Анализ кальция Биолюминесценция для функционального анализа Mosquito ( Aedes aegypti) И Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G-белком рецепторы

1. Создание стабильных клеточных линий Клонировать ваши GPCR интересов и вставьте его в вектор экспрессии включающий 5 'Козак консенсусной последовательности (GCCA / GCCATGG) вокруг стартовый кодон для оптимального связывания рибосом в системе млекопитающих (Козак, 1986). Здесь мы используем плазмиды pcDNA3.1/Bm-KR за тик кининовой рецепторов, и плазмиды pcDNA3.1/Aedae-KR для комаров рецепторов кининовой (Holmes и др., 2003;. Pietrantonio и др., 2005.). PcDNA3.1 (-) вектор кодирует ампициллину отбора у бактерий и неомицин (G418) сопротивления для выбора в клетках млекопитающих. Расти СНО-К1 пустых ячеек (без плазмид) (АТСС, Манассас, Вирджиния, США) или другую нужную линию клеток в Т-25 колбе (BD Falcon) при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора увлажненный (Holmes и др. ., 2003). Все дальнейшие инкубации должно быть сделано в этих условиях, если не указано иное. Поддерживать пустых ячеек в ростовой среде (F12K среде с 10% эмбриональной телячьей сыворотки) с 1X противогрибковым антибиотикам (Invitrogen, Калифорния). Чтобы разделить клетки, разогреть все решения до 37 ° C. Удалить старые среды в Т-25 колбы и промыть 5 мл PBS, а затем удалить PBS. Для trypsinize клетки, добавьте 2 мл PBS-Трипсин-EDTA (34 мл PBS, 2 мл 7,5% бикарбоната натрия, 4 мл 10X трипсина-EDTA) в течение 2 мин. Добавьте 3 мл среды и аспирации среду вверх и вниз, смешать клетки. Передача среды с клетками в конической трубе и центрифуги в течение 2 мин при температуре ~ 200-300 г (1.000 оборотов в минуту). Удалите супернатант и вновь приостановить клетки в 5 мл среды. Развести ресуспендировали клетки концентрации 1:05 или 1:10 свежей средой и передачи 5 мл в новые Т-25 колбу. После клетки растут здоровыми (около 2-3 дней), семян CHO-K1 клеток в Т-25 колб культуре ткани и выращивать их на ночь в ростовой среде без антибиотиков, пока они примерно на 30% сливной (примерно 18 часов). Степень слияния может быть определена путем наблюдения клеток под перевернутой флуоресцентной микроскопии. Подготовка следующей смеси для каждого образца: Комбинат 1-2 мкг ДНК (например: использование 4μl из 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) с 100 мкл Opti-MEM я уменьшил сыворотки Средняя (Invitrogen). Смешать 6 мкл реагента липофектина (InvitrogenTM) в 100 мкл F12K бессывороточной среде, что делает соотношении 1:1 из липофектина с ДНК. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30-45 мин. Аккуратно перемешайте решений от 1.5.1 с 1.5.2 по каплям моды (общий объем = 200 мкл). Дайте постоять при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Удалите старый средний рост из клеток и промыть клетки с 5 мл F12K бессывороточной среде, а затем удалить F12K бессывороточной среды. В 15 мл трубки, осторожно перемешать трансфекции смесь в 1,8 мл свежей среды F12K в каплям моды. Затем, промывают клетки с шага 1.5 с PBS и добавить это новое решение для трансфекции клеток. Инкубируйте в течение 18 часов. Изменение средних F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки без антибиотиков и инкубировать в течение ночи. Разделение на две клетки Т-25 колб с F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки без антибиотиков еще на 18 часов (для разделения клетки см. шаг 1.3). Замените среду с селективной средой (F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 800μg/ml генетицину, Invitrogen). Культуры клеток с использованием селективной среде в течение 3-4 недель. Со временем это будет выбрать для клеток, которые стабильно включены плазмиды в их геномной ДНК. Дальнейшая поддержка клеток с использованием обслуживание среды (F12K средний плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 400μg/ml генетицину). Периодически замораживания клеточных линий с соотношением 1:1 замораживания средств массовой информации (селективной среде с 20% ДМСО), чтобы предотвратить потери в случае неожиданного загрязнения. Выбор клональных клеточных линий: в качестве первого шага, trypsinize и центрифуги клетки шагом 1,8 с обеспечением среде, как в шаге 1.3. Повторное приостановить клеток в 5 средних обслуживание мл, принимать по 0,5 мл ячейки приостановить и добавить 4,5 мл свежей среды, техническое обслуживание, чтобы сделать 10-кратным разбавлением. Трансфер 10-кратным разбавлением на 12 лунки 96-луночного планшета, добавив 100 мкл в каждую лунку, чтобы выбрать для одиночных клеток. Продолжайте делать 10x серийные разведения этих клеток для теоретического окончательное приостановление одной клетки на 100 мкл (как правило, конечное разведение будет находиться в диапазоне от 10 -11 до 10 -19; общее количество 10x серийные разведения составляет ~ 19) . Сразу же после каждого разбавления, передача 100 мкл разведения на 12 скважинах 96 ячейках. После 18 часов инкубации, соблюдать 96-луночных под перевернутой света флуоресценции или скважин микроскопом и отметить, что по всей видимости, содержать только одну ячейку или содержать две клетки, которые, очевидно, разделились из одной единственной клетки. Продолжайте наблюдение каждый день, и изменение среды каждые три дня. Когда скважин на 80% confluЛОР (около недели), промыть отмечен скважин с 200 мкл PBS и trypsinize их с 100 мкл PBS-трипсина-EDTA решение. Передача клетки от каждого отмечен также в одну лунку 6-луночный планшет с 1 средний обслуживание мл. Вырастить эти клетки в течение 3 дней, после чего передача клеток в отдельных T25 колбу. Проверьте эти клетки, используя анализ кальция биолюминесценции с агонистом пептидов (см. раздел 2). Выберите один из клеточной линии шагом 1,11 с самым высоким ответ в пластине анализа биолюминесценции кальция и выполнять во второй раз одну ячейку выбор следующие шаги 1.9-1.11. Периодически замораживания клеточных линий. Из вторичного выделения, описанных в пункте 1.12, выбрать 2-3 клеточные линии с высоким ответ в пластине анализа биолюминесценции кальция и поддерживать их в культуре для дальнейших анализов биолюминесценции кальция пластины. Следите за проход чисел. Время от времени, замораживать клеточные линии с раннего проходы так, что вы всегда можете вернуться к ним, если клеточных линий с более проходов прекратить выполнение последовательно. 2. Пластины кальция биолюминесценции анализа Лигировать репортер гена в вектор экспрессии. Здесь мы использовали aequorin плазмиды mtAEQ/pcDNA1 (подарок от доктора. CJP Grimmelikhuijzen и Майкл Уильямсон, Копенгагенский университет, Дания). Преобразование плазмиды в E. кишечной клетки MC1061/PS (Invitrogen) и очищать их с помощью QIAprep спина miniprep комплект (Qiagen Inc.) На заключительном этапе вымывается плазмиду с Tris буфера без ЭДТА, а не воды. Расти клеточных линиях, начиная с шага 1,13 выразить желаемое рецепторов в поддержании среды. Когда клетки на 90% сливающиеся, trypsinize, центрифуги, а затем снова приостановить клетки в 5 мл обслуживания среды как в шаге 1.3. Развести клетки (около 10 раз с сохранением среды) и подсчитать количество клеток с сотовыми счетчик (Bright-Line Hemacytometer) под микроскопом. Настройте номер ячейки примерно 2 х 10 5 клеток / мл (в среднем 20 ячеек в одном из 9 квадратов показали в Hemacytometer). Семенной 2 мл разбавленной клеток в средствах массовой информации в каждую лунку шесть хорошо пластины. Инкубируйте в течение 24 часов (клетки должны составить около 60% слияния после инкубации). Изменение информации в 6 пластины скважин OPTI-MEM среде. Для каждой скважины, смешайте 96 мкл OPTI-MEM с 4 мкл FuGENE 6 Трансфекция реагента (Roche Biochemicals) в микроцентрифужную трубку и пусть сидят при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 1 мкг aequorin / pcDNA 1 плазмида ДНК в каждой пробирке, а затем аккуратно встряхнуть образца в течение 1 мин, инкубировать при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Добавить каждой смеси в каждую лунку в моде в то время как по каплям осторожно встряхивая и пластины. Инкубируйте пластин в течение 6 часов и изменение средних F12K среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки без антибиотика. После инкубации клеток в шесть хорошо пластине в течение 24 часов, trypsinize, центрифугу и вновь приостановить клетки шагом 1.3. Граф номер ячейки до 400000 клеток / мл, как шаг 2,1 и передачи 100 мкл (всего 40000 cells/100 мкл) в каждую лунку 96-луночного белой тонкой нижней планшет (Costar 3610). Инкубируйте в течение еще 24 часов, пока около 80% слияния ячейки. Это оптимальная концентрация клеток для биолюминесценции анализа. Подготовка 90μl/well из кальция, свободных средств массовой информации DMEM (Invitrogen), содержащий 5 мкМ coelenterazine (Invitrogen) в темноте (coelenterazine является светочувствительным). Возьмите пластину с 2,4, удалите старые медиа и добавьте эту 90μl в каждую лунку. Инкубируйте пластин в течение 3 часов в темноте при 37 ° С и 5% CO 2, после чего клетки пластины готовы к тестированию. 3. Эксплуатация прибора и анализа данных Каждый читатель биолюминесценции пластина отличается. Мы выполняем наши методом с использованием NOVOstar (BMG Labtechnologies) ридер в bioluminensence режиме. Если вы используете другой инструмент, необходимо адаптировать протокол. Чистки ридер насосов (или премьер-НАСОСЫ) перед использованием. Выключите свет в комнате, прежде чем положить пластинку на пластине держателя. Как только пластина держателя закрыл, включить свет. Солюбилизации пептидов (в 1,5 мл Eppendorf трубки) в кальция, свободных средств массовой информации DMEM. Установить "Аспирируйте Глубина» и «определение местоположения» пептида раствор перед использованием. Вызов ячейки с 10 мкл (10x) различной концентрации пептидов (FFFSWG-NH2, Aedes-К1-3, или другой желаемой пептид) и сразу же начать запись светового излучения. Мы создали инструмент для записи светового излучения (465 нм) для каждой скважины каждые 2 секунды в течение всего времени 50 секунд. Обязательно укажите положительного контроля, такие как активный аналоговый (аналоговый FFFSWGa была использована, Taneja-Bageshwar и соавт., 2009) и отрицательного контроля, такие как вектор только трансфекции клеток. Отрицательного контроля необходимо во время анализа данных, чтобы установить базовые порога (см. представитель результатов).Не связаны, неактивный пептид также может быть добавлен в качестве отрицательного контроля. После запуска завершен, промывайте инструмент насоса (или премьер-насосы), то место вашего следующего образца пептида. Сохраните данные и промыть насос снова. Обработка данных: Передача данных светового излучения из каждой лунки в лист Microsoft Excel данных. Вставить данные из Excel в Призма программного обеспечения от 4,0 GraphPad Software Inc (Сан-Диего, Калифорния, США). Различных концентрациях пептида по оси Х и биолюминесценции единиц Y-оси. Для нормализации данных, участок лог-ответ кривой. Выберите нелинейной регрессии кривая соответствует анализа (сигмоидального доза-реакция уравнения с переменным наклоном), чтобы получить реакции на концентрацию кривые для каждого пептида. Программа участки значения, в конце концов и дает ЕС 50. Каждый эксперимент следует повторить три раза для анализа данных. 4. Представитель Результаты: При выраженных в СНО-К1 клетки, комаров Aedes aegypti кининовой рецептор вел себя как multiligand рецепторов и функционально ответил на таких низких концентрациях, как 1 нМ из трех endogenours Aedes кинины, Aedae кинины 1-3, испытаны отдельно использованием пластин кальцием биолюминесценции анализа . На рисунке 1 показано, что ранг порядке потенции полученный Aedae-К-3> Aedae-К-2> Aedae-K-1, основанного на соответствующих ЭК 50 значений Aedae-К-3, 16,04 нм; Aedae-K- 2, 26,6 нМ и Aedae-К-1, 48,85 нм, что было статистически значимо отличается (P <0,05) (Pietrantonio и соавт., 2005). Мы также использовали этот анализ, чтобы определить, какие кининовой остатков имеют решающее значение для кининовой пептид-рецепторного взаимодействия. Пептиды насекомых кининовой доля С-концевой пентапептида, который представляет минимальную последовательность, необходимые для биологической активности, также известный как ядро. В таблице 1, кининовой аналогов основных пептида были синтезированы, как аланин серии замена основных кининовой пентапептида FFSWGa и проверены пластины кальцием биолюминесценции анализа (Taneja-Bageshwar и соавт., 2006). Мы обнаружили, что аминокислоты Phe 1 и Trp 4 имеют существенное значение для деятельности насекомых кинины для обоих рецепторов. Анализ также может быть использован для тестирования пептидов предназначен для расширения биостойкость. Таблица 2 показывает, предназначенные кининовой аналогов содержащие аминокислоты изомасляной кислоты (AIB) проверено на тик рекомбинантный рецептор кининовой и Рисунок 2 показывает активность сравнение шести альфа-амино изомасляной аналогов кислоты на рецепторы тик кининовой выражения СНО-К1 клеточной линии от кальция биолюминесценции пластины анализа (Taneja-Bageshwar и соавт., 2009). Гексапептид аналоговых FFFSWGa добавляется для положительного контроля для активности рецепторов. Аналоговые FF [Айб] WGA привел более активно, чем это гексапептид аналогового управления. Аналоговый с двумя заменами aminoisobutyric кислота, [Айб] FF [Айб] WGA, был самым мощным из двойной замены аналогов испытания (табл. 2 и рис 2). Дополнительные примеры того, как этот анализ был и может быть применен видеть Нахмана и Pietantonio (2010), Нахмана и соавт. (2009), Taneja-Bageshwar и соавт. (2008a), а Taneja-Bageshwar и соавт. (2008b). Рисунок 1. Оценка Aedes кинины эффективной концентрации (ЕС 50) на СНО-К1 E10 клеток кальцием биолюминесценции пластины теста. Оси ординат в реакции на концентрацию кривых была получена из биолюминесценции единиц выражается в процентах от максимальной реакция, наблюдаемая для каждого пептида. Данные точки представляют собой в среднем по шесть повторяет, полученные в ходе трех независимых экспериментах. Столбики показывают стандартную ошибку. () Оценка Aedae-K1 ЕС 50 = 48 нМ. (В) Оценка Aedae-K2 ЕС 50 = 26 нМ. (C) Оценка Aedae-K3 ЕС 50 = 16 нМ. ЭК 50 Aedae-K3 <ЭК 50 Aedae-K2 <ЭК 50 Aedae-К1, р <0,05. Статистический анализ и графики были с программным обеспечением GraphPad Призма 4.0. Рисунок 2. Активность сравнение шести альфа-амино изомасляной аналогов кислоты на тик кининовой рецептор выразив СНО-К1 клеточной линии на пластине анализа биолюминесценции кальция. Оси ординат представляет процент максимальной единицы биолюминесценции для каждого аналогового выраженное в процентах биолюминесценции наблюдается при концентрации по сравнению с максимальным реакция, наблюдаемая среди всех протестированных концентраций для каждого аналога. Статистический анализ и графики были выполнены с GraphPad программного обеспечения Призма 4.0. Тик линии клеточного рецептора Mosquito рецепторов клеточной линии </TR> Пептиды ЭК 50 (нм) Максимальный отклик биолюминесценции на 1 мМ ЭК 50 (нм) Максимальный отклик биолюминесценции на 1 мМ AFSWGa Я Я Я Я FASWGa 586 5600 Н. Д. 400 FFAWGa 64 12800 621 3050 FFSAGa Я Я Я Я FFSWAa 417 10600 2800 1830 FFSWGa 590 10800 Н. Д. 525 FSWGa Я Я Я Я FFSWa Я Я Я Я FFSWG-OH Я Я Я Я FFFSWGa 259 13000 562 10000 FF [Айб] WGA 29 12700 445 9300 Таблица 1. Расчетное потенции (ЕС 50) и максимальный ответ биолюминесценции всех пептидов протестирован на клещей и комаров рецепторов трансфекции клеточных линий *. * ЕС 50 оценки концентрации, необходимой, чтобы вызвать полумаксимальной ответ. Я: не активизированы, если биолюминесценции ответа составляет менее 300 единиц (уровень вектор-только трансфекции клеток). : Положение, когда соответствующие остатки в пептидных FFSWGa был заменен аланина. Н. Д.: аналоговый была протестирована, но либо не очень активны или не активны в нижней molarities, таким образом, EC50 не может быть определен. K-Айб-1 [Айб] FF [Айб] WGA K-Айб-2 [Α MeF] FF [Айб] WGA K-Айб-3 Ас-R [Айб] FF [Айб] WGA K-Айб-4 Ас-R [β3F] FF [Айб] WGA K-Айб-5 [Айб] RFF [Айб] WGA K-Айб-6 [AIB-AIB-AIB-Айб] RFF [Айб] WGA Таблица 2. Кининовой аналогов (К), содержащего аминокислоты изомасляной кислоты (AIB) проверено на тик рекомбинантный кининовой рецепторов. Ac: ацетил; α мне: α метил-фенилаланин; β3F: β3-фенилаланин;: амида.