Эластомерные PGS Строительные леса в Артериальная тканевой инженерии
Summary
Эластомерные PGS леса с гладкомышечных клеток сосудов культивировали в биореактор пульсирующего потока может привести к перспективным малого диаметра артериальных конструкций с отечественного производства ЕСМ в относительно короткий период культуры.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания является одной из ведущих причин смертности в США и, особенно, ишемической болезни сердца увеличивается с старением населения и увеличением ожирения 1. В настоящее время операции шунтирования использовании аутологичных сосудов, аллотрансплантатов и синтетических трансплантатов известны как обычно используются для артериальной заменители 2. Однако эти трансплантаты имеют ограниченное применение, когда внутренний диаметр артерий менее 6 мм из-за низкой доступности, тромботические осложнения, соответствие несоответствия, и поздно гиперплазии интимы 3,4. Чтобы преодолеть эти ограничения, тканевой инженерии была успешно применена в качестве перспективной альтернативой для развития малого диаметра артериальных конструкций, которые nonthrombogenic, надежные и совместимые. Некоторые предыдущие исследования разработали малого диаметра артериальных конструкций с три-слоистой структуры, отличные механические свойства и давление разрыва сопоставимы с родной артерий 5,6. Хотя высокая прочность на разрыв и давление разрыва за счет увеличения производства коллагена из жесткого материала, или ячейку листа эшафот, эти конструкции еще низкого уровня производства эластина и соблюдения, которая представляет собой серьезную проблему вызывают недостаточность трансплантата после имплантации. Рассматривая эти вопросы, мы предположили, что эластомерный биоматериала в сочетании с механической кондиционирования обеспечит упругость и проведения механических сигналов более эффективно сосудистых клеток, которые увеличивают производство внеклеточной матрицы и поддержку сотовых ориентации.
Цель настоящего доклада заключается во внедрении техники изготовления пористых трубчатых лесов и динамические механические условий для применения их к артериальной тканевой инженерии. Мы использовали биологически эластомера, поли (глицерин sebacate) (PGS) 7 для изготовления пористых трубчатых лесов от метода слияния соли. Взрослый первичной бабуина гладкомышечных клеток (ГМК) были посеяны на просвете леса, которые культивируются в нашей разработан пульсирующего потока биореакторе в течение 3 недель. PGS леса были последовательно толщины и случайным образом распределены макро-и микро-поры. Механические кондиционирования с пульсирующим потоком биореакторе поддерживают SMC ориентации и расширение ECM производства в строительные леса. Эти результаты показывают, что эластомерных лесов и механического кондиционирования биореактор культура может быть перспективным методом артериальной тканевой инженерии.
Protocol
Discussion
Изготовление технологии с использованием биологически эластомера, описанные здесь есть несколько особенностей. (1) Мы использовали гиалуроновой кислоты (ГК) в качестве формы выпуска. С HA растворяется в воде, эшафот был легко освобождается от стекла форму после замачивания его в воду. В этом отчете мы использовали 1,0 вес / объем% раствора HA потому низких концентрациях (<0,5 вес / объем%) из раствора не вязкая и течет так быстро, когда мы заливки его на верхней части стеклянной трубки. Для пальто решение HA равномерно, мы перевернули стеклянной трубки, когда решение полетел вниз нижней части трубы и повторил этот шаг. Это покрытие ГК решающее значение для нашего производства процедуру выпуска окончательной лесов. (2) Мы использовали термоусаживаемые (HS) рукав для сохранения солей в стеклянных трубок. Так как соли были плотно упакованы в пространство между внутренней стенкой трубы стекло и рукава HS, HS рукав сохранил солей после удаления оправки и PTFE кольцо в нижней части трубы. Мы могли бы удалить HS рукав легко, поставив формы в духовке при 120 ° С в течение 5 мин, а затем получить трубчатых шаблоны соли. (3) Мы использовали метод соль синтеза. Хорошо известно, что метод соль слияние может улучшить пор взаимосвязанности и механических свойств при изменении слияние время 10. Кроме того, поскольку мы использовали PGS, макро-поры были произведены частицы соли во время процесса выщелачивания, а микро-поры, скорее всего, порожденных глицерина паров, образующихся при лечении PGS, как мы описали ранее 11. Таким образом, этот метод имеет потенциал для изготовления пористых трубчатых лесов с различными макро-и микро-структурах посредством изменения частицы соли, а также PGS лечения состояние.
Механические кондиционирования от биореактора предоставил пульсирующей перфузии потока (максимальный средний расход = 14 мл / мин, максимальное касательное напряжение = 15,3 дин / см 2, частота = 0,5 – 1,7 Гц) и физиологически соответствующим давлением с PGS лесов, что привело к SMC роста и ориентации (рис. 4). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, сообщает, что циклические растянуть на этой частоте и напряжение сдвига увеличивается распространение SMC 12 и ECM белка 13,14. В дополнение к SMC роста и ориентации, PGS построить поддерживает ECM белка, особенно окружности организованной эластичных волокон (рис. 5) в течение 3-недельного культуры в биореакторе. Некоторые исследования с использованием эластомерных эшафот как малого диаметра артериальных построить продемонстрировали механическую прочность и разрывное давление сравнимо с родной артерий 15 и быстрой интеграции в SMC совместимый леса использованием счетчика колбу 16,17, в то время не эластичные волокна были обнаружены в этих конструкций. Наши результаты показывают, что циклическое растяжение с радиальным биореактор повышенной механической передачи сигнала более эффективно для ГМК в PGS эшафот, что, вероятно, способствовали синтез эластина и организации.
С сосудистых ГМК были только клетки, которые производятся ECM белков в нашем подходе, покоя эндотелия и улучшения механической прочности необходимы для развития клинически успешной малого диаметра артериальных конструкций. Мы сообщили, что эндотелиальные клетки совместно культивировали с ГМК порожденных сливающийся монослой и поддерживается выражением фенотип белка в нашей культуре условий и механических кондиционирования 9. Поэтому, исходя из нашего подхода, описанные здесь, изменение со-культуре условиях эксперимента будет следующим шагом для улучшения функции результирующей конструкции и генерировать nonthrombogenic, надежные и совместимые артериальной построить похож на родной артерий.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор благодарит доктора Jin Гао для PGS синтез, д-р Питер Крапо для проницательных обсуждения для биореактора установки, д-ра. Мохамед Ezzelarab и Вэй Ву для культивирующий в искусственной среде бабуина сонных артерий. Это исследование было поддержано грантом Национального института здоровья (R01 HL089658).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 |
| MCDB 131 | Mediatech | 15-100-CV |
| Fetal bovine serum | Lonza | BW14-502F |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005-CV |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 |
| Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech | 30-004-CI |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-031-CV |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
References
- The American Heart Association Statistics Committee Stroke Statistics Subcommittee. American Heart Association: Heart disease and stroke statistics-2009 update. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Isenberg, B. C., Williams, C., Tranquillo, R. T. Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ Res. 98, 25-35 (2006).
- Conte, M. S. The ideal small arterial substitute: a search for the Holy Grail. FASEB J. 12, 43-45 (1998).
- Wang, X., Lin, P., Yao, Q., Chen, C. Development of small-diameter vascular grafts. World J Surg. 31, 682-689 (2007).
- L’Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12, 47-56 (1998).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. A tough biodegradable elastomer. Nat Biotechnol. 20, 602-606 (2002).
- Crapo, P. M., Gao, J., Wang, Y. Seamless tubular poly(glycerol sebacate) scaffolds: high-yield fabrication and potential applications. J Biomed Mater Res A. 86, 354-363 (2008).
- Gao, J., Ensley, A. E., Nerem, R. M., Wang, Y. Poly(glycerol sebacate) supports the proliferation and phenotypic protein expression of primary baboon vascular cells. J Biomed Mater Res A. 83, 1070-1075 (2007).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Gao, J., Crapo, P. M., Wang, Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. Tissue Eng. 12, 917-925 (2006).
- Wilson, E., Mai, Q., Sudhir, K., Weiss, R. H., Ives, H. E. Mechanical strain induces growth of vascular smooth muscle cells via autocrine action of PDGF. J Cell Biol. 123, 741-747 (1993).
- Leung, D. Y., Glagov, S., Mathews, M. B. Cyclic stretching stimulates synthesis of matrix components by arterial smooth muscle cells in vitro. Science. 191, 475-477 (1976).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Yang, J., Motlagh, D., Webb, A. R., Ameer, G. A. Novel biphasic elastomeric scaffold for small-diameter blood vessel tissue engineering. Tissue Eng. 11, 1876-1886 (2005).
- Stankus, J. J., Soletti, L., Fujimoto, K., Hong, Y., Vorp, D. A., Wagner, W. R. Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization. Biomaterials. 28, 2738-2746 (2007).
- Nieponice, A., Soletti, L., Guan, J., Deasy, B. M., Huard, J., Wagner, W. R., Vorp, D. A. Development of a tissue-engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique. Biomaterials. 29, 825-833 (2008).
