Elastomeer PGS Steigers in Arterial Tissue Engineering
Summary
Elastomeer PGS steigers met vasculaire gladde spiercellen gekweekt in een pulsatiele flow bioreactor kan leiden tot veelbelovende kleine diameter arteriële constructen met inheemse ECM productie in een relatief korte periode van cultuur.
Abstract
Hart-en vaatziekten is een van de belangrijkste oorzaak van sterfte in de Verenigde Staten en in het bijzonder, coronaire hartziekte stijgt met de vergrijzing van de bevolking en toenemende zwaarlijvigheid 1. Op dit moment, bypass-operatie met behulp van autoloog schepen, allografts, en synthetische enten staan bekend als een vaak gebruikt voor arteriële vervangers 2. Echter, deze enten hebben een beperkte toepassingen wanneer een inwendige diameter van de slagaders is minder dan 6 mm, door de lage beschikbaarheid, trombotische complicaties, compliance mismatch, en laat intima hyperplasie 3,4. Om deze beperkingen, is tissue engineering met succes toegepast als een veelbelovend alternatief voor de kleine diameter arteriële constructies die zijn nonthrombogenic, robuust, en compliant te ontwikkelen. Verschillende eerdere studies hebben een kleine diameter arteriële constructen met tri-lamellaire structuur, uitstekende mechanische eigenschappen en de barstdruk die vergelijkbaar zijn met inheemse slagaders 5,6. Terwijl de hoge treksterkte en barstdruk door het verhogen van de productie van collageen uit een stijf materiaal of cel blad steiger, deze constructies nog weinig elastine productie-en compliance, dat is een groot probleem te enten storing veroorzaken na implantatie. Rekening houdend met deze zaken, hebben we de hypothese dat een elastometric biomateriaal gecombineerd met een mechanische conditioning zou elasticiteit en het gedrag van mechanische signalen meer efficiënt vasculaire cellen, die extracellulaire matrix productie te verhogen en te ondersteunen cellulaire oriëntatie.
Het doel van dit rapport is de invoering van een fabricage techniek van poreuze buis steigers en een dynamisch mechanisch conditioneren voor de toe te passen op arteriële tissue engineering. We gebruikten een biologisch afbreekbare elastomeer, poly (glycerol sebacaat) (PGS) 7 voor het vervaardigen van poreuze buisvormige steigers van het zout fusion-methode. Volwassen primaire baviaan gladde spiercellen (SMC) werden geënt op het lumen van de steigers, die in onze ontworpen pulsatiele flow bioreactor gekweekt voor 3 weken. PGS steigers had constante dikte en willekeurig verdeeld macro-en micro-poriën. Mechanische conditioning van pulsatiele flow bioreactor ondersteund SMC oriëntatie en verbeterde ECM productie in de steigers. Deze resultaten suggereren dat elastomeer steigers en mechanische conditionering van bioreactor cultuur kan een veelbelovende methode voor arteriële tissue engineering worden.
Protocol
Discussion
De fabricage techniek met behulp van een biologisch afbreekbare elastomeer hier beschreven heeft verschillende functies. (1) Wij gebruikten hyaluronzuur (HA) als het insmeren. Omdat HA is oplosbaar in water, was steiger gemakkelijk vrijgelaten uit de glazen vorm na laten weken in water. In dit rapport, gebruikten we 1,0 gew / vol% van de HA-oplossing, omdat een lage concentratie (<0,5 gew / vol%) van de oplossing is niet viskeus en naar beneden stroomt zo snel als we gieten op de top van glazen buizen. De vacht HA-oplossing gelijkmatig, we omgedraaid de glazen buizen als de oplossing vloog de bodem van de buis en herhaalde deze stap. Dit HA coating is een cruciaal belang voor onze fabricage procedure voor het vrijgeven van de definitieve steigers. (2) Wij gebruikten warmtekrimpbare (HS) hoes voor het behoud van zouten in de glazen buizen. Omdat zouten werden dicht op elkaar gepakt in de ruimte tussen de binnenwand van de glazen buizen en de HS mouw, HS sleeve behouden zouten na het verwijderen van doorn en PTFE-ring in de bodem van de buis. We kunnen verwijderen GS mouw gemakkelijk Door de mal in een oven op 120 ° C gedurende 5 min, en dan krijg buisvormige zout templates. (3) Wij gebruikten het zout fusion-methode. Het is bekend dat zout fusie methode kan porie interconnectiviteit en mechanische eigenschappen te verbeteren door het variëren van fusie tijd 10. Aangezien we vroeger PGS, waren de macro-poriën die door het zout deeltjes tijdens het uitlogen proces, terwijl de micro-poriën waren waarschijnlijk gegenereerd door glycerol damp gevormd tijdens de PGS uitharden zoals we eerder beschreven 11. Dus deze methode heeft een potentieel om poreuze buisvormige steigers fabriceren met verschillende macro-en micro-structuren door het variëren van zout deeltjes evenals PGS genezen aandoening.
De mechanische conditionering van de bioreactor heeft pulsatiele flow perfusie (maximale gemiddelde flow = 14 ml / min, maximum schuifspanning = 15,3 dyne / cm 2, frequentie = 0,5 tot 1,7 Hz) en fysiologisch relevante druk met de PGS schavot, wat leidde tot SMC groei en oriëntatie (afb. 4). Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere studies melden dat cyclische rek bij deze frequentie en shear stress verhoogt SMC proliferatie 12, en ECM eiwitproductie 13,14. Naast de SMC de groei en de oriëntatie, PGS bouwen ondersteund ECM eiwitproductie, in het bijzonder de omtrek elastische vezels (Fig. 5) binnen de 3-week cultuur in de bioreactor georganiseerd. Sommige studies met behulp van een elastomeer steiger als een kleine diameter arteriële constructie hebben aangetoond dat mechanische sterkte en de barstdruk die vergelijkbaar zijn met inheemse slagaders 15, en snelle integratie in de SMC compliant steigers met behulp van centrifugekolf 16,17, terwijl er geen elastische vezels werden gevonden in deze constructen. Onze resultaten suggereren dat cyclische radiale uitzetting van de bioreactor verbeterde mechanische signaaltransductie meer effectief te SMC in PGS steiger, die waarschijnlijk heeft bijgedragen aan de synthese en organisatie elastine.
Sinds vasculaire SMC waren de enige cellen die ECM eiwitten geproduceerd in onze aanpak, rustige endotheel en verbeteren van mechanische sterkte die nodig zijn om een klinisch succesvolle kleine diameter arteriële constructies te ontwikkelen. We hebben gemeld dat endotheelcellen samen gekweekt met SMC's gegenereerd een confluente monolaag en ondersteund fenotype eiwitexpressie onder onze cultuur en de mechanische conditionering 9. Daarom, op basis van onze aanpak hier beschreven, wijziging van co-cultuur experiment omstandigheden zou een volgende stap om de functies van de resulterende constructen te verbeteren en het genereren van nonthrombogenic, robuust zijn, en voldoen arteriële bouwen vergelijkbaar met inheemse slagaders.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur bedankt dr. Jin Gao voor synthese PGS, dr. Peter Crapo voor inzichtelijke discussie voor bioreactor setup, Drs. Mohamed Ezzelarab en Wei Wu voor explanting baviaan halsslagaders. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R01 HL089658).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 |
| MCDB 131 | Mediatech | 15-100-CV |
| Fetal bovine serum | Lonza | BW14-502F |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005-CV |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 |
| Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech | 30-004-CI |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-031-CV |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
References
- The American Heart Association Statistics Committee Stroke Statistics Subcommittee. American Heart Association: Heart disease and stroke statistics-2009 update. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Isenberg, B. C., Williams, C., Tranquillo, R. T. Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ Res. 98, 25-35 (2006).
- Conte, M. S. The ideal small arterial substitute: a search for the Holy Grail. FASEB J. 12, 43-45 (1998).
- Wang, X., Lin, P., Yao, Q., Chen, C. Development of small-diameter vascular grafts. World J Surg. 31, 682-689 (2007).
- L’Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12, 47-56 (1998).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. A tough biodegradable elastomer. Nat Biotechnol. 20, 602-606 (2002).
- Crapo, P. M., Gao, J., Wang, Y. Seamless tubular poly(glycerol sebacate) scaffolds: high-yield fabrication and potential applications. J Biomed Mater Res A. 86, 354-363 (2008).
- Gao, J., Ensley, A. E., Nerem, R. M., Wang, Y. Poly(glycerol sebacate) supports the proliferation and phenotypic protein expression of primary baboon vascular cells. J Biomed Mater Res A. 83, 1070-1075 (2007).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Gao, J., Crapo, P. M., Wang, Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. Tissue Eng. 12, 917-925 (2006).
- Wilson, E., Mai, Q., Sudhir, K., Weiss, R. H., Ives, H. E. Mechanical strain induces growth of vascular smooth muscle cells via autocrine action of PDGF. J Cell Biol. 123, 741-747 (1993).
- Leung, D. Y., Glagov, S., Mathews, M. B. Cyclic stretching stimulates synthesis of matrix components by arterial smooth muscle cells in vitro. Science. 191, 475-477 (1976).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Yang, J., Motlagh, D., Webb, A. R., Ameer, G. A. Novel biphasic elastomeric scaffold for small-diameter blood vessel tissue engineering. Tissue Eng. 11, 1876-1886 (2005).
- Stankus, J. J., Soletti, L., Fujimoto, K., Hong, Y., Vorp, D. A., Wagner, W. R. Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization. Biomaterials. 28, 2738-2746 (2007).
- Nieponice, A., Soletti, L., Guan, J., Deasy, B. M., Huard, J., Wagner, W. R., Vorp, D. A. Development of a tissue-engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique. Biomaterials. 29, 825-833 (2008).
