PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים
Summary
PGS אלסטומרי פיגומים עם כלי הדם לתאי שריר חלק בתרבית bioreactor זרימה pulsatile עלול להוביל בקוטר קטן בונה מבטיח עורקי עם ייצור ECM יליד בתקופה התרבות קצר יחסית.
Abstract
מחלות לב וכלי דם הוא אחד הגורם המוביל לתמותה בארה"ב במיוחד, מחלת לב כלילית עולה עם האוכלוסייה המזדקנת והשמנה הגדלת 1. נכון לעכשיו, ניתוח מעקפים באמצעות כלי עצמיים, allografts, ואת שתלי סינתטי ידועים כמו נפוץ תחליפי עורקים 2. עם זאת, שתלי אלה יש יישומים מוגבלים כאשר הקוטר הפנימי של העורקים הוא פחות מ 6 מ"מ בשל זמינות נמוכה, סיבוכים טרומבוטיים, התאמה תאימות היפרפלזיה intimal מאוחר 3,4. כדי להתגבר על המגבלות האלה, הנדסת רקמות יושם בהצלחה כחלופה מבטיח לפתח קטן בקוטר בונה עורקי כי הם nonthrombogenic, חזקים, ותואמת. מחקרים קודמים מספר פיתחו בקוטר קטן בונה עורקי עם מבנה תלת lamellar, תכונות מכניות מעולה הלחץ פרץ להשוות העורקים יליד 5,6. למרות חוזק מתיחה גבוה ולחץ פרץ ידי הגברת ייצור הקולגן מחומר נוקשה או סדין בתא הגרדום, המבנים הללו עדיין ייצור האלסטין ציות נמוך, וזה בעיה רצינית כדי לגרום לכישלון השתל לאחר ההשתלה. לאור בעיות אלו, אנו משערים כי elastometric ביולוגי בשילוב עם מיזוג מכני תספק גמישות והתנהגות אותות מכני יעיל יותר לתאי הדם, אשר להגביר את ייצור תאי מטריקס ותמיכה אוריינטציה הסלולר.
מטרת דו"ח זה היא להציג את טכניקת ייצור של פיגומים צינורי נקבוביים מיזוג מכני דינמי והחלתן על הנדסת רקמות העורקים. השתמשנו אלסטומר מתכלה, פולי (sebacate גליצרול) (PGS) 7 בודה פיגומים צינורי נקבובי מן השיטה היתוך מלח. למבוגרים חלקה העיקרי הבבון שריר תאים (SMCs) היו זורעים על לומן של פיגומים, אשר בתרבית bioreactor תוכנן שלנו לזרום pulsatile למשך 3 שבועות. פיגומים PGS היה עקבי עובי ומופץ באופן אקראי מאקרו ומיקרו הנקבוביות. מיזוג מכונות מ bioreactor תזרים pulsatile נתמך SMC התמצאות משופרת ייצור ECM של פיגומים. התוצאות מראות כי פיגומים אלסטומרי ומיזוג מכני של התרבות bioreactor עשוי להיות שיטה מבטיחה עבור הנדסת רקמות העורקים.
Protocol
Discussion
טכניקת ייצור באמצעות אלסטומר מתכלה המתוארים כאן יש כמה תכונות. (1) השתמשנו חומצה היאלורונית (HA) כמו לשחרר עובש. מאז HA הוא מסיס במים, הפיגום השתחרר בקלות לאחר שריה אותו לתוך מים עובש הזכוכית. בדו"ח זה, השתמשנו 1.0 wt / כרך% של פתרון HA בגלל ריכוז נמוך (<0.5 wt / כרך%) של הפתרון הוא לא צמיג זורם למטה כל כך מהר כשאנחנו לשפוך אותו על גבי צינורות זכוכית. כדי פתרון HA מעיל אחיד, אנו התהפך צינור הזכוכית כאשר הפתרון הנמיכה את החלק התחתון של הצינור וחזר על שלב זה. זה ציפוי HA הוא קריטי בהליך הייצור שלנו לשחרור פיגומים הסופי. (2) השתמשנו חום כויץ (HS) שרוול עבור שמירה מלחים בצינור הזכוכית. מאז היו מלחים בצפיפות במרחב שבין הקיר הפנימי של צינורות זכוכית השרוול HS, שרוול HS שמר מלחים לאחר הסרת mandrel וטבעת PTFE בחלקו התחתון של הצינור. אנחנו יכולים להסיר שרוול HS בקלות על ידי הצבת את התבנית לתנור על 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לקבל תבניות מלח צינורי. (3) השתמשנו בשיטה היתוך מלח. זה ידוע היטב כי היתוך שיטה מלח יכולה לשפר interconnectivity נקבוביות תכונות מכניות על ידי שינוי זמן היתוך 10. יתר על כן, מאז השתמשנו PGS, מאקרו הנקבוביות יוצרו על ידי חלקיקי מלח בתהליך שטיפת, ואילו המיקרו נקבוביות נוצרו ככל הנראה על ידי אדי גליצרול נוצרו במהלך PGS ריפוי כפי שתואר קודם לכן 11. לכן, בשיטה זו יש פוטנציאל לייצר פיגומים צינורי נקבובי עם מאקרו שונים מיקרו מבנים על ידי שינוי חלקיקי מלח, כמו גם בריפוי מצב PGS.
מיזוג מכני מ bioreactor סיפקה זלוף תזרים pulsatile (מקסימום אומרת זרימה = 14 מ"ל / דקה, הלחץ גזירה מרבי = 15.3 Dyne / 2 ס"מ, תדירות = 0.5-1.7 הרץ) ו – פיזיולוגית הלחץ רלוונטי עם הפיגום PGS, אשר הובילה SMC צמיחה אוריינטציה (איור 4). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים קודמים דיווח כי למתוח מחזורית בתדר זה הלחץ גזירה מגבירה SMC התפשטות 12, ECM ייצור החלבון 13,14. בנוסף לצמיחה SMC והכיוון, PGS לבנות נתמך ECM ייצור חלבון, במיוחד מאורגן circumferentially סיבים אלסטיים (איור 5) בתוך התרבות 3-שבוע bioreactor. כמה מחקרים באמצעות אלסטומרי פיגום כמבנה קטן בקוטר העורקים הראו חוזק מכני והלחץ פרץ להשוות העורקים יליד 15, ושילוב SMC המהירה פיגומים תואם באמצעות בקבוק טווה 16,17, בעוד סיבים אלסטיים לא נמצאו מבנים אלה. התוצאות שלנו מראים כי distension רדיאלי מחזורית מן bioreactor השתפר הולכת אותות מכני יעיל יותר SMCs ב PGS הפיגום, אשר ככל הנראה תרמו ואלסטין סינתזה הארגון.
מאז SMCs כלי הדם היו רק תאים שייצרו חלבונים ECM של האנדותל שלנו, הגישה שקט ולשפר את חוזק מכני יש צורך לפתח מוצלח קלינית בקוטר קטן בונה העורקים. יש לנו דיווח כי לתאי אנדותל שיתוף תרבותי עם SMCs שנוצר monolayer ומחוברות ותמך חלבון ביטוי פנוטיפ בתנאים התרבות שלנו ומיזוג מכני 9. לכן, בהתבסס על הגישה שלנו המתואר כאן, שינוי של שיתוף התרבות תנאי הניסוי יהיה הצעד הבא כדי לשפר את הפונקציות של המבנים כתוצאה וליצור nonthrombogenic, החזקה, ואת עורקי תואם לבנות דומה העורקים הילידים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מודה ד"ר ג'ין גאו לסינתזה PGS, ד"ר פיטר Crapo לדיון תובנה bioreactor עבור ההתקנה, בני הזוג. מוחמד Ezzelarab ו ווי וו עבור explanting הבבון עורקי הראש. מחקר זה מומן על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (R01 HL089658).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 |
| MCDB 131 | Mediatech | 15-100-CV |
| Fetal bovine serum | Lonza | BW14-502F |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005-CV |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 |
| Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech | 30-004-CI |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-031-CV |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
References
- The American Heart Association Statistics Committee Stroke Statistics Subcommittee. American Heart Association: Heart disease and stroke statistics-2009 update. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Isenberg, B. C., Williams, C., Tranquillo, R. T. Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ Res. 98, 25-35 (2006).
- Conte, M. S. The ideal small arterial substitute: a search for the Holy Grail. FASEB J. 12, 43-45 (1998).
- Wang, X., Lin, P., Yao, Q., Chen, C. Development of small-diameter vascular grafts. World J Surg. 31, 682-689 (2007).
- L’Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12, 47-56 (1998).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. A tough biodegradable elastomer. Nat Biotechnol. 20, 602-606 (2002).
- Crapo, P. M., Gao, J., Wang, Y. Seamless tubular poly(glycerol sebacate) scaffolds: high-yield fabrication and potential applications. J Biomed Mater Res A. 86, 354-363 (2008).
- Gao, J., Ensley, A. E., Nerem, R. M., Wang, Y. Poly(glycerol sebacate) supports the proliferation and phenotypic protein expression of primary baboon vascular cells. J Biomed Mater Res A. 83, 1070-1075 (2007).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Gao, J., Crapo, P. M., Wang, Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. Tissue Eng. 12, 917-925 (2006).
- Wilson, E., Mai, Q., Sudhir, K., Weiss, R. H., Ives, H. E. Mechanical strain induces growth of vascular smooth muscle cells via autocrine action of PDGF. J Cell Biol. 123, 741-747 (1993).
- Leung, D. Y., Glagov, S., Mathews, M. B. Cyclic stretching stimulates synthesis of matrix components by arterial smooth muscle cells in vitro. Science. 191, 475-477 (1976).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Yang, J., Motlagh, D., Webb, A. R., Ameer, G. A. Novel biphasic elastomeric scaffold for small-diameter blood vessel tissue engineering. Tissue Eng. 11, 1876-1886 (2005).
- Stankus, J. J., Soletti, L., Fujimoto, K., Hong, Y., Vorp, D. A., Wagner, W. R. Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization. Biomaterials. 28, 2738-2746 (2007).
- Nieponice, A., Soletti, L., Guan, J., Deasy, B. M., Huard, J., Wagner, W. R., Vorp, D. A. Development of a tissue-engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique. Biomaterials. 29, 825-833 (2008).
