PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

1. Andaime Tubular Fabricação Prepare tubos de vidro (comprimento = 70 mm, diâmetro externo = 9,0 mm, espessura da parede = 1,0 mm; peças pequenas, Miramar, FL) como um molde para andaime. Prepare 1,0 wt / vol% ácido hialurônico (AH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pela dissolução de 100 mg de HA em 10 ml de água deionizada. Misture usando um rotator durante a noite até que não haja bolhas de ar na solução. Despeje solução de HA de 1,0% no topo do tubo de vidro. Deixe-a fluir lentamente ao longo da parede interna do molde. Vire o tubo quando a solução atingiu o fundo do molde usando o rotator e repita este passo até que a parede interna do molde é revestido uniformemente pela solução. Após o revestimento, seque todas as tubulações de vidro no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h. Moer e partículas de sal peneira (size = 25-32 mm) usado como porogens. Montar um tubo de vidro (interior revestido com 1,0% HA solução), mandril (aço inoxidável revestido por tubo de PTFE), calor shrinkable luva (HS), e PTFE anel, conforme descrito anteriormente 8. Adicionar partículas de sal do tamanho desejado para o molde de vidro com uma espátula através do funil de borracha de silicone. Toque o molde com cuidado para assegurar uma distribuição uniforme de partículas de sal. Raspe as partículas excesso de sal na parte superior do molde usando o lado da espátula. Ligue a hibridização incubadora por 30 minutos antes de transferir o molde de sal embalado. Desligue a hibridização incubadora e Coloque o sal-embalados molde para a hibridização incubadora para a fusão de sal. Remove os moldes da hibridação incubadora e seque-as no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h. Remove os moldes de sal-embalados do forno a vácuo e deixe esfriar em temperatura ambiente. Remova o mandril de aço inoxidável, empurrando-a para baixo com segurando o anel PTFE. Se o mandril é demasiado apertado para o molde, use o alicate para puxá-lo para fora. Remova o anel de PTFE a partir do fundo do molde. Coloque os moldes no forno a 120 ° C por 5 min para termoencolhíveis HS. Verificar se a luva HS é encolhido. Remova a luva HS a partir dos moldes de sal embalado e deixe esfriar em temperatura ambiente. Manter os moldes para o exsicador até que eles são usados. Prepare a solução PGS dissolvendo 3 g de PGS em 15 ml de tetraidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para formar um wt 20 / vol solução%. Adicionar a solução PGS para o lúmen de sal-embalados moldes, largando-o usando um spoid na capa hume. Magra o molde de vidro cerca de 45 ° e soltar a solução PGS em lúmen interno com rotação do molde lentamente. Verifique se a solução PGS flui para baixo ao longo da parede do molde. Se lugar seco é observado, adicione mais solução. Após a adição da solução PGS, coloque os moldes no bairro hume por pelo menos 30 min para a evaporação THF. Coloque os moldes no forno a vácuo para pré-determinado o tempo de cura (ex. 24/36 / 48 h) a 100 mTorr e 150 ° C para a PGS cura. Após a cura, tire os moldes e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Dip cada molde para a água deionizada com posição vertical lentamente. Não mergulhe-os na água rapidamente, porque as bolhas de ar podem causar desgaste ao cadafalso. Transferir os moldes para o banho de água com cuidado e coloque-os em um ângulo de 1 h usando tubo de silicone para dissolver HA facilmente. Verifique se HA é dissolvido a partir do molde. Se não HA é liberado a partir do molde, empurre a uma extremidade do andaime lentamente usando a espátula para soltá-la do molde. Repita este passo na outra extremidade do andaime e agitar o molde e para trás lentamente em banho-maria. Verifique se o andaime é movido dentro do molde. Transferir o andaime para outro banho-maria com agitador com cuidado. Não pegue o andaime firme, o que pode rachar o cadafalso. Coloque o andaime no banho de água por pelo menos três dias com a mudança de água para lixiviar as partículas de sal. Depois de lixiviação de partículas de sal, a transferência de cada cadafalso para o tubo de centrifugação de 15 ml preenchido com a água deionizada e coloque-os na caixa de gelo seco por 1 h para congelar. Colocar tubos de centrífuga para o liofilizador (todos os táxis do tubo devem ser abertas) e lyophilize-los durante 2 dias. Coloque todos os andaimes para o dessecador antes até que elas são usadas. 2. Preparação para o cadafalso Seeding celular Retire andaimes do exsicador e cortá-los até 25-30mm de comprimento. Prepare duas rolhas de borracha de silicone (diâmetro = 20 mm, espessura da parede = 6,35 mm, diâmetro do furo do meio = 3 mm) e conectar dois tubos de PTFE (diâmetro externo = 3,97 milímetros, diâmetro interno = 2,38 milímetros, espessura da parede = 0,79 mm, comprimento = 60 mm e 40 mm) através dos furos meio de cada rolha. Corte um anel como um HS 1.5 mm de comprimento e colocá-lo em cima de uma das extremidades do andaime. Empurrar um tubo de PTFE (ligado rolha de borracha de silicone) em uma extremidade de andaime como parte sobreposição menor possível. Coloque o tubo de andaime e PTFE para o forno a 120 ° C por 10 min a encolher anel HS. Verifique se o anel de HS é encolhido e andaimes são conectados a tubagem de PTFE com firmeza. Retire o tubo de andaime e PTFE e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Coloque o conjunto tubo de andaime-PTFE para dentro do tubo de policarbonato (diâmetro externo = 15,5 mm, diâmetro interno = 9 mm, comprimento = 50 mm) como uma câmara de biorreator. Conectar outro final de tubagem de PTFE para o cadafalso como passos 2.3) e 2.4). Ajustar duas rolhas de borracha de silicone para fixar suas superfícies internas de ambas as extremidades do tubo de policarbonato. Prenda as duas superfícies externas de rolhas de borracha de silicone para duas placas de liga de alumínio (superior e inferior; width = 20 mm, comprimento = 70 mm, espessura = 6,35 mm). Coloque duas varas enfiadas no buraco do lado da placa e fixar o tubo de policarbonato (incluído o interior andaime) para placas apertando o parafuso porca polegar no prato. Medir o comprimento de cada seedable andaime (comprimento entre dois anéis HS) e calcular a área da superfície interna (π x comprimento x diâmetro interior seedable) de cada andaime para a semeadura de células. Enrole uma unidade de câmara de biorreator com papel alumínio e esterilizar em autoclave a 120 ° C por 30 min. Esterilizar cada parte (reservatório de meio, a tubulação da bomba, trocador de gás, manifolds, e válvula de agulha) do biorreator em autoclave a 120 ° C por 30 min e montá-los dentro do capô de cultura de células. Pré-tratamento e enxaguar andaimes com uma série de perfusões (70, 50 e 25% de etanol para 1 h, tampão fosfato (PBS; Mediatech, Herndon, VA) por 2 h, e meio de cultura SMC por 24 h, utilizando uma bomba peristáltica em 1,0 ml / min no circuito de fluxo. 3. Seeding celular e Cultura Isolar arterial primária células musculares lisas (PMEs) das artérias carótidas de juvenis de babuínos machos (Papio anubis) e caracterizá-los em duas dimensões da cultura (2D) antes passaging e semeadura, como descrito anteriormente 9. Expandir SMCs usando o MCDB 131 médio (Mediatech, Herndon, VA) com 10% de soro fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamina (Mediatech), 50 mcg / ml de ácido ascórbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), e uma solução antibiótica-antimicótica (10.000 UI / ml de penicilina, 10.000 mg / ml, estreptomicina e 25 mg / ml anfotericina B; Mediatech). Retire cada câmara biorreator do circuito de fluxo no biorreator. SMCs semente (passagem 4-6) para o cadafalso com uma densidade de 2×10 6 células / cm 2 através da injeção de suspensão com 5 ml no lúmen de andaimes, após cortar os abluminal (entrada) e luminal (saída) os fluxos. Coloque todas as câmaras de biorreatores para a hibridização incubadora a 37 ° C e gire-a 2 rpm por 4 h para permitir que as células a se espalhar uniformemente no cadafalso. Retire câmaras biorreator da hibridação incubadora anexá-los ao fluxo de circuito do biorreator na capa. Transferência de todo o sistema de cultura de células em biorreatores incubadora. Conecte a tubulação da bomba (diâmetro interno = 1,6 mm) para a cartilagem da bomba peristáltica e carregar meio de cultura novo no reservatório. Iniciar a perfusão através de parede (luminal para abluminal) em 1,0 ml / min para 15 min seguido de fluxo luminal só. Aumentar a taxa de fluxo e pressão gradualmente a partir de 1,0 ml / min (estresse de cisalhamento luminal: 1.1 dinas / cm 2) e 20 mmHg no dia 1-14,2 ml / min (15,3 dinas / cm 2) e 120 mmHg no dia 21, respectivamente. Alterar a tubulação da bomba (diâmetro interno = 3,2 mm) no dia 4 e meio uma vez por semana. 4. A colheita de tecidos e Preparação de Amostras para Análise Após o cultivo de 21 dias, parar a bomba e tubulações braçadeira (entrada e saída) do reservatório de médio porte. Separar a tubulação da bomba a partir da cartilagem da bomba peristáltica e um sistema de biorreator transferência para o capô. Braçadeira de entrada e tubulações de saída de cada câmara de reactores biológicos e retirá-la da alça fluxo. Abra o tubo de admissão e preparar um prato de petri-na tubulação de saída para coletar meio de cultura no interior do tubo de policarbonato. Abrir a tubulação de saída de forma lenta e remova a mídia da câmara. Separar agulha abluminal e tubos de silicone luminal da câmara e retire placas de alumínio, liberando parafusos. Retire o tubo de policarbonato e retire uma das extremidades do tecido construção da tubulação de PTFE. Prepare um prato de petri preenchida com 10 ml de PBS e retire outro lado da construção da tubulação de PTFE. Coloque construir no PBS e lavar três vezes. Corte a construir com uma lâmina de barbear como 5 mm de comprimento. Congelar a -80 ° C para o congelador bioquímica ou transferi-lo para 15 tubo de centrifugação ml preenchida com 5 ml de meio fresco para testes mecânicos ou congelar encaixem no composto temperatura Tissue-Tek ideal de corte (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) para histologia / immunoflucoloração orescence. 5. Resultados representativos: Os andaimes tubular PGS foram confeccionadas em elastômeros biodegradáveis ​​pelo método de sal de fusão (Fig. 1A). Cada câmara biorreator desde andaimes com os fluxos tanto luminal e abluminal e poderia ser destacado como uma unidade separada de um loop de fluxo principal (Figura 1B). Biorreator sistema foi projetado para cultura quatro andaimes de uma vez por meio do controle e monitoramento de fluxo, bem como a pressão (Fig. 1C e D). Esquemática da cultura biorreator foi mostrado na figura. 2. Após a semeadura SMCs, cada câmara biorreator foi rodado a 37 ° C por 4 h para distribuir uniformemente as células no lúmen do andaime. E, em seguida, o fluxo pulsátil foi aplicado para andaimes até o dia 14 com taxa de fluxo aumentando gradualmente (Fig. 2A) e pressão (Fig. 2B). Após o dia 14, o fluxo ea pressão mantida constante até o final da cultura (dia 21). Morfologia da superfície do andaime PGS foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Microscopia eletrônica de varredura mostrou que andaime tinha parede consistente espessuras (539 ± 18 mm) (Fig. 3A) e distribuídos aleatoriamente macro e micro-poros na superfície luminal (Fig. 3B). Parâmetros morfométricos do andaime foi medido a partir microcomputed tomografia (micro-CT) e análise de imagem. Tamanho dos poros média é de 23,3 ± 3,9 mm e interconectividade dos poros é 99,4 ± 0,62%, o que significa que todos os poros estão totalmente interligados em andaime. Porosidade medidos pelo deslocamento de etanol é de 75,6 ± 2,7%. Morfologia celular da construção PGS foi examinado por MEV (Fig. 4). SMCs multicamadas completamente coberto a superfície luminal e eles foram orientados perpendicularmente ao sentido do fluxo. Estes resultados mostram que o condicionamento mecânico de biorreator fluxo pulsátil suporta orientação SMC no cadafalso. A presença de matriz extracelular (ECM) e fibras elásticas foram examinadas por H & E e coloração autofluorescência elastina (Fig. 5). Coloração H & E demonstraram que as células e proteínas ECM completamente coberto do lúmen do PGS construir. Elastina autofluorescência também mostrou organizadas circunferencialmente fibras elásticas na superfície luminal do construto. Produção de proteínas ECM em construções PGS foram medidos a partir ensaios bioquímicos. A elastina e conteúdo de colágeno insolúvel foram 20,2 ± 9,1 mg / mg de tecido e de 6,3 ± 1,9 mg / mg de tecido, respectivamente. Figura 1. Scaffold fabricação e sistema de biorreatores. (A) Esquema de andaime tubular de fabricação. (B) da câmara biorreator. Andaimes foram conectados a tubagem de PTFE, colocadas dentro do tubo de policarbonato, e fixado por rolhas de borracha de silicone e placas de liga de alumínio. Cada câmara tem dois caminhos de fluxo: fluxo luminal (por tubo de silicone) e abluminal (por agulha). (C) sistema de biorreator colocado dentro da incubadora. Inclui reservatório de meio, módulo de bomba peristáltica, trocador de gás, transdutores de pressão, dois manifolds (superior e inferior), e válvula de agulha. (D) sistema de biorreator colocado fora da incubadora. Ele inclui monitor de pressão, unidade de controle de fluxo, dados do sistema, aquisição e computador. Figura 2. Esquemática da cultura biorreator. (A) protocolo de Cultura. (B) Aplicada perfis de pressão em cada ponto do tempo (dia 1, 4, 7 e 14). Figura 3. Morfologia da superfície do andaime PGS. (A) Corte transversal. (B) Lumen. Figura 4. Morfologia celular da PGS construir. (A) Lumen. (B) Seção transversal de corte 45 °. Setas em ambos os números representam a direção do fluxo. Figura 5. Histologia e elastina autofluorescência do PGS construir. (A) coloração H & E. (B) autofluorescência elastina correspondentes. L: lúmen. Ampliação: 40X. Barra de escala: 50 mm.