Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama
Summary
EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.
Abstract
DNA hydroxymethylation DNA bilinen uzun bir değişiklik, ancak son zamanlarda bir epigenetik araştırma odağı haline gelmiştir. Memeli DNA enzimatik CpG dinükleotidleri bağlamda ağırlıklı olarak, 5-mC sitozin (C) kalıntılarının 5. karbon pozisyonunda değiştirilmiş. 5-mC, geliştirme ve hastalık yer olduğuna inanılan enzimlerin Tet aile, 5-HMC enzimatik oksidasyon için uygun. Şu anda, 5-HMC biyolojik rolü tam olarak anlaşılmış değildir, fakat bir biyolojik belirteç olarak potansiyeli nedeniyle ilgi bir sürü oluşturuyor. Bu fare embriyonik kök (ES) ve nöronal hücrelerin 5-hydroxymethylcytosine tespit birçok çığır açan çalışmaları nedeniyle.
Bisülfit sıralama yöntemleri de dahil olmak üzere, Araştırma Teknikleri, 5-mC ve 5-HMC kolayca ayırt etmek mümkün değildir. Birkaç protokoller sıvı kromatografisi kütle spektrometresi analizi veya genomik DNA sindirilmiş tek nükleosidlerin ince tabaka kromatografisi ile birleştiğinde de dahil olmak üzere, genom küresel miktarda 5-hydroxymethylcytosine ölçebilirsiniz var. Dot blot analizi, immünofloresan, ya da hydroxymethylated DNA yağış için kullanılabilir, ancak bu antikorlar tek baz resolution.In Ayrıca zorunda değilsiniz Antikorlar, hedef 5-hydroxymethylcytosine de var olduğunu, çözünürlük immunoprecipitated DNA ve büyüklüğüne göre değişir mikroarray deneyler, prob tasarımı bağlıdır. 5-hydroxymethylcytosine epigenetik düzenleme genom ya da rolünü tam olarak nerede var bilinmediğinden, bu yeni teknikler, lokus spesifik hydroxymethylation belirlemek için gereklidir. EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, bu iki özel lokusların değişiklikler arasında ayrım için bir çözüm sağlar.
EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, 5-methylcytosine ve belirli bir DNA lokus içinde 5-hydroxymethylcytosine tanımlanması ve kantitatif için basit ve sağlam bir yöntem. Bu enzimatik yaklaşım, basit 3 adım protokol isoschizomers MspI ve HpaII diferansiyel metilasyon duyarlılığı kullanır.
5-hydroxymethylcytosine glukoz moeity ekleyerek, ilgi Genomik DNA T4 BGT ile tedavi edilir. Bu reaksiyon dizisi bağımsız, bu nedenle 5-HMC glucosylated olacak; değiştirilmemiş veya 5-mC içeren DNA etkilenmeyecektir.
Bu glucosylation sonra kısıtlama endonükleaz sindirim tarafından takip edilmektedir. MspI ve HpaII aynı sıra (CCGG) farkındayız ama farklı metilasyon devletlere duyarlıdır. Sitozin blokları bölünme ya da herhangi bir değişiklik (5-mC, 5-HMC veya 5-ghmC): HpaII sadece bir sitenin tamamen değiştirilmemiş parçalayarak. MspI 5-mC ve 5-HMC, ama 5-ghmC tanır ve keser.
Protokol üçüncü bölümü PCR ile odağı sorgulama. Giriş DNA az 20 ng kullanılabilir. Deneysel (glucosylated ve sindirilmiş) ve kontrol (alay glucosylated ve sindirilmiş) bir ilgi CCGG sitesi (100-200 bp) yan primerler ile hedef DNA amplifikasyonu yapılır. CpG sitesi 5-hydroxymethylcytosine içeriyorsa, bir grup glucosylation ve sindirim sonra tespit, ancak olmayan glucosylated bir tepki olarak değil. Gerçek zamanlı PCR hydroxymethylcytosine bu özel site ne kadar bir yaklaşım verecektir.
Bu deneyde, bir fare Babl / C beyin örnek 5-hydroxymethylcytosine miktarı bitiş noktası PCR ile analiz eder.
Protocol
Discussion
Bu deneyde kurarken pek çok kritik şeyler var. İlk olarak, genomik DNA glucosylation tamamlanması için devam eder önemlidir. T4 BGT dizisi özgüllüğü bilinen ve substrat dizisi için başka seçeneğimiz yok gibi görünüyor. Bu nedenle, bazı durumlarda, daha uzun inkübasyon sürelerinde gerekli olabilir. İkincisi, MspI ve HpaII sindirim arka plan sinyal önlemek için tam olmalıdır. Bu kısıtlama enzimler için, 4 saatlik bir inkübasyon süresi tavsiye, ama eksik bölünme görülmektedir uzun inkubasyon yapılabilir. Üçüncü, giriş DNA miktarı 20 NGS DNA son nokta PCR için kullanılan bu yana, yer olup olmamasına bağlı olarak ayarlanabilir. Son olarak, 5-mC ve 5-HMC kantifikasyon genomik DNA ile paralel olarak çalıştırmak olabilir sağlanan kontrol DNA kullanmanızı öneririz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, Steven E. Jacobsen s laboratuar, UCLA. Bu çalışma kısmen NIH 1R44GM095209-01 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | ||
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | |||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | ||
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | ||
| molecular biology grade water |
References
- Sadri, R. . Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
- Mathur, E. J. . Gene. 108, 1-6 (1991).
- Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. . Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. . Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. . Science. 324, 930-935 (2009).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. . PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).
