Alta sensibilidad de detección de 5 hidroximetilcitosina en el tejido cerebral Balb / C
Summary
El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis se puede utilizar para analizar y cuantificar la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina dentro de un lugar específico de la SPE. El kit distingue 5-MC de 5 HMC por la adición de glucosa al grupo hidroxilo de la 5-HMC a través de una reacción enzimática utilizando β-glucosiltransferasa (T4-BGT). Cuando el 5-HMC se produce en el contexto de las CCGG, esta modificación convierte un sitio escindible MspI a un sitio no escindibles.
Abstract
Hidroximetilación ADN es una modificación del ADN desde hace mucho tiempo, pero recientemente se ha convertido en un foco de la investigación epigenética. ADN de los mamíferos es enzimáticamente modificados en la posición del carbono 5 de la citosina (C) de residuos de 5-MC, principalmente en el contexto de los dinucleótidos CpG. 5-MC es susceptible a la oxidación enzimática en 5-HMC por la familia de las enzimas del Tet, que se cree que están involucrados en el desarrollo y la enfermedad. En la actualidad, el papel biológico de la 5-HMC no se entiende completamente, pero está generando un gran interés debido a su potencial como biomarcador. Esto se debe a varios estudios innovadores identificar 5 hidroximetilcitosina en madre embrionarias de ratón (ES) y las células neuronales.
Técnicas de investigación, incluyendo los métodos de secuenciación de bisulfito, son incapaces de distinguir fácilmente entre 5-MC y 5 HMC. A pocos protocolos existentes que se pueden medir las cantidades globales de la 5-hidroximetilcitosina en el genoma, incluyendo cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas o análisis de cromatografía en capa fina de nucleósidos individuales de ADN genómico digerido. Los anticuerpos que se dirigen a 5 hidroximetilcitosina también existen, que pueden ser utilizados para el análisis de transferencia de puntos, inmunofluorescencia, o la precipitación del ADN hydroxymethylated, pero estos anticuerpos no tienen una sola Además resolution.In base, la resolución depende del tamaño del ADN immunoprecipitated y para experimentos de microarrays, depende del diseño de la sonda. Dado que no se sabe exactamente donde 5 hidroximetilcitosina existe en el genoma o de su papel en la regulación epigenética, se requieren nuevas técnicas que se pueden identificar hidroximetilación lugar específico. El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis ofrece una solución para distinguir entre estas dos modificaciones en lugares específicos.
El EpiMark 5 HMC y 5-mC Análisis Kit es un método simple y robusto para la identificación y cuantificación de 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina dentro de un locus específicos de ADN. Este enfoque enzimática utiliza la sensibilidad de metilación diferencial de la MspI y HpaII isoschizomers de una manera simple de 3 pasos de protocolo.
ADN genómico de interés es tratado con T4-BGT, la adición de un moeity glucosa al 5-hidroximetilcitosina. Esta reacción es independiente de la secuencia, por lo tanto, todos los 5 HMC se glucosilada, sin modificar o 5-mC ADN que contiene no se verá afectada.
Esta glucosilación es seguido por la digestión con endonucleasas de restricción. MspI y HpaII reconoce la misma secuencia (CCGG), pero son sensibles a los estados de metilación diferente. HpaII unirá sólo un sitio, sin ninguna modificación: cualquier modificación (5-mC, 5-HMC o 5 ghmC), ya sea en bloques división citosina. MspI reconoce y se une 5-MC y 5 HMC-, pero no de 5 ghmC.
La tercera parte del protocolo es la interrogación de la legitimación por PCR. Tan sólo 20 ng de DNA de entrada puede ser utilizado. La amplificación de la experimental (glucosilada y digeridos) y control (modelo glucosilada y digeridos) ADN diana con los primers que flanquean un sitio de interés CCGG (100-200 pb) se lleva a cabo. Si el sitio contiene 5-CpG hidroximetilcitosina, una banda se detecta después de glucosilación y la digestión, pero no en la reacción de control no glucosilada. PCR en tiempo real le dará una aproximación de cuánto es hidroximetilcitosina en este sitio en particular.
En este experimento, vamos a analizar la cantidad de 5 hidroximetilcitosina en una muestra de cerebro de ratón Babl / C por PCR de punto final.
Protocol
Discussion
Hay varias cosas fundamentales para tener en cuenta al crear este experimento. En primer lugar, es importante que la glucosilación de ADN genómico procede a la terminación. La especificidad de la secuencia de la T4-BGT no se conoce, y parece que no tienen otra opción para la secuencia de sustrato. Por lo tanto, en algunos casos, mayor tiempo de incubación puede ser necesario. Segunda digestión, MspI y HpaII debe ser completa a fin de evitar la señal de fondo. Por estas enzimas de restricción, se recomienda un tiempo de incubación de 4 horas, pero ya incubaciones se puede realizar cuando se observa división incompleta. En tercer lugar, la cantidad de entrada de ADN se puede ajustar dependiendo de la disponibilidad, desde el 20 de NGS de ADN puede ser utilizado para la PCR de punto final. Finalmente, se recomienda el uso de ADN de control suministrado, que pueden funcionar en paralelo con el ADN genómico de 5-MC y la cuantificación de 5 HMC.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang barbilla Gyeong, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, el laboratorio de Steven E. Jacobsen s, UCLA. Este trabajo fue parcialmente financiado por el NIH 1R44GM095209-01.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | ||
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | |||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | ||
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | ||
| molecular biology grade water |
References
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