רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

1. ה-DNA Glucosylation בקרת תגובות בתוך צינור תגובה 1.5 למיליליטר על קרח, לערבב 50-10 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי (ריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל), 12.4 מיקרוליטר של גלוקוז-UDP (ריכוז סופי של מיקרו 80), 31 מיקרוליטר של NEBuffer 4 עד 310 מיקרוליטר nuclease ללא מים להביא את הנפח הכולל עד 310 מיקרוליטר. פיצול זה תערובת התגובה לשני צינורות של 155 מיקרוליטר אחד. ואז להוסיף 30 יחידות, או 3 מיקרוליטר, של T4-β-glucosyltransferase אל צינור אחד. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. הצינור השני הוא תגובה מלאה, אז להוסיף 3 מיקרוליטר של מים, במקום T4-BGT. דגירה שני צינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 18 שעות, במהלכן T4-BGT יוסיף גלוקוז לקבוצת הידרוקסיל של 5-hydroxymethylcytosine קבוצות המדגם. 2. אנזים הגבלה עיכול Three לייבל 0.2 למיליליטר PCR-רצועת צינורות המספרים 1 עד 3. 50 Aliquot ul של התערובת לתוך כל תגובה. Three לייבל 0.2 למיליליטר PCR-רצועת צינורות מספרים 4 עד 6. 50 Aliquot ul של התערובת לתוך כל בקרה. הוספת 100 יחידות, או 1 microliter, של MspI לתוך צינורות 1 ו -4. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. הוספת 50 יחידות, או 1 microliter, של HpaII לתוך צינורות 2 ו -5. מערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. אל תוסיף כלום צינורות 3 ו – 6, כפי שהם שולטת. דגירה כל 6 צינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות. הוסף 1 microliter של proteinase K לתוך הצינור כל לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. להשבית K proteinase ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. 3. ניתוח ה-DNA על ידי ה-PCR / qPCR פרוטוקול זה משתמש LongAmp חוד של תקי עבור נקודת הסיום PCR אשר הוכח מתפקדים היטב. פרוטוקולים אחרים PCR ניתן להחליף. מוסיפים את הרכיבים הבאים אל צינור 0.2 PCR התגובה למיליליטר על הקרח: 10 מיקרוליטר של הצפת התגובה 5X תקי LongAmp, 1.5 מיקרוליטר של 10 dNTPs millimolar, 1 microliter של מיקרו פריימר 10 קדימה, 1 microliter של פריימר 10 הפוך מיקרו, 3 מיקרוליטר של תבנית ה-DNA מן השלבים הקודמים, 1 microliter של פולימראז הדנ"א תקי LongAmp ו nuclease ללא מים עד 50 מיקרוליטר. כרכים אלה עשויים להשתנות על פי פרוטוקול ה-PCR בשימוש. לערבב בעדינות את התגובה. במידת הצורך, לאסוף את כל נוזל אל החלק התחתון של הצינור על ידי ספין מהיר. כיסוי המדגם עם שמן מינרלי אם באמצעות thermocycler ללא מכסה מחומם. העברת צינורות PCR מן הקרח thermocycler עם לחסום את שחומם מראש ל 94 מעלות צלזיוס להפעיל את תוכנית רכיבה על אופניים. עבור לשגרה 3-PCR צעד, לא אמורה להיות צעד אחד denaturation הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס denaturation למשך 15 שניות, 55-65 מעלות צלסיוס חישול למשך 30 שניות, ו – 65 מעלות צלסיוס הארכה למשך 20 שניות, או 50 שניות לכל kb. זו צריכה להיות מלווה הארכה אחת אחרונה ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בזמן אמת PCR ניתן גם לבצע כדי לכמת את הסכומים של 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine. עיין במדריך המוצר, נמצא על neb.com למידע ספציפי. 4. נציג תוצאות: באיור 1. השוואה בין 5-hydroxymethylcytosine בסכומים מוקד 12 ב שונה Balb / C דגימות רקמות העכבר. (א), נקודת הסיום PCR. (ב), בזמן אמת PCR. ה-DNA מארבע רקמות העכבר נותח. לצורך ההשוואה, בזמן אמת PCR היו נתונים מנורמל ל-DNA נימול. עקומת סטנדרט היה בשימוש כדי לקבוע מספר עותק. הדגימות יכול להיות מנורמל על ידי חלוקת מספר עותק של דגימות לא 1-6 במספר עותק של שליטה כי הוא לא מעוכלים (לא 5). מסלול ג'ל Boxed מראה וריאציה בהווה 5-HMC.