High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale
Summary
Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.
Abstract
Hydroxymethylation DNA è una modificazione del DNA da tempo, ma recentemente è diventato un focus di ricerca epigenetica. DNA dei mammiferi è enzimaticamente modificati nella posizione di carbonio 5 ° della citosina (C) residui a 5-MC, prevalentemente nel contesto di dinucleotidi CpG. 5-MC è suscettibile di ossidazione enzimatica a 5-HMC dalla famiglia Tet di enzimi, che si ritiene siano coinvolti nello sviluppo e nella malattia. Attualmente, il ruolo biologico di 5-HMC non è pienamente compreso, ma sta generando molto interesse a causa della sua potenzialità come biomarker. Ciò è dovuto a diversi studi innovativi di identificazione 5-hydroxymethylcytosine nel topo staminali embrionali (ES) e le cellule neuronali.
Tecniche di ricerca, compresi i metodi di sequenziamento bisolfito, non sono in grado di distinguere facilmente tra i 5-MC e 5-HMC. Un protocolli esistono pochi in grado di misurare quantità globale di 5-hydroxymethylcytosine nel genoma, tra cui la cromatografia liquida accoppiata con l'analisi di spettrometria di massa e cromatografia su strato sottile di nucleosidi singolo digerito dal DNA genomico. Gli anticorpi che colpiscono 5-hydroxymethylcytosine esistono anche, che può essere utilizzato per l'analisi dot blot, immunofluorescenza, o precipitazione del DNA hydroxymethylated, ma questi anticorpi non hanno singola aggiunta resolution.In di base, la risoluzione dipende dalle dimensioni del DNA immunoprecipitato e per esperimenti di microarray, dipende dal disegno della sonda. Dal momento che non si sa esattamente dove 5-hydroxymethylcytosine esiste nel genoma o il suo ruolo nella regolazione epigenetica, nuove tecniche, sono necessari in grado di identificare hydroxymethylation specifico locus. Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Analisi Kit offre una soluzione di distinzione tra questi due modifiche a loci specifici.
Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Analisi Kit è un metodo semplice e robusto per l'identificazione e quantificazione di 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un locus DNA specifico. Questo approccio enzimatica utilizza la sensibilità metilazione differenziale dei MspI isoschizomers e HpaII in un semplice 3-step del protocollo.
DNA genomico di interesse è trattato con T4-BGT, aggiungendo un moeity glucosio al 5-hydroxymethylcytosine. Questa reazione è sequenza-indipendente, quindi tutti i 5-HMC sarà glucosilati, non modificato o 5-mC DNA contenente non saranno interessati.
Questo glucosylation è poi seguita dalla digestione di restrizione endonucleasi. MspI e HpaII riconoscere la stessa sequenza (CCGG), ma sono sensibili a diversi stati di metilazione. HpaII si unirà solo un sito completamente modificato: ogni modifica (5-mC, 5-HMC o 5-ghmC) sia a scissione citosina blocchi. MspI riconosce e si unirà a 5 mC e 5-HMC, ma non 5-ghmC.
La terza parte del protocollo è interrogatorio del locus mediante PCR. Appena 20 ng di DNA di ingresso possono essere utilizzati. Amplificazione della sperimentazione (glucosilati e digerito) e di controllo (finto glucosilati e digerito) DNA bersaglio con primer che fiancheggiano un sito CCGG di interesse (100-200 bp) viene eseguita. Se il sito CpG contiene 5-hydroxymethylcytosine, una band viene rilevato dopo glucosylation e la digestione, ma non nel non-glucosilati reazione di controllo. PCR in tempo reale darà un'approssimazione di quanto hydroxymethylcytosine è in questo particolare sito.
In questo esperimento, analizzeremo il 5-hydroxymethylcytosine quantità in un Babl / C campione di cervello di topo per punto PCR finale.
Protocol
Discussion
Ci sono parecchie cose fondamentali da considerare nella creazione di questo esperimento. In primo luogo, è importante che il glucosylation di DNA genomico procede al completamento. La specificità sequenza di T4-BGT non è nota, e sembra non avere altra scelta per la sequenza di substrato. Pertanto, in alcuni casi, i tempi di incubazione più lungo può essere necessario. In secondo luogo la digestione, MspI e HpaII deve essere completa in modo da evitare segnale di fondo. Per questi enzimi di restrizione, si consiglia un tempo di incubazione di 4 ore, ma più incubazioni può essere eseguita quando scissione incompleta è osservato. In terzo luogo, il DNA quantità di ingresso può essere regolata a seconda della disponibilità, dal 20 NGS del DNA può essere usato per end-point PCR. Infine, si consiglia l'uso del DNA di controllo in dotazione, che può essere eseguito in parallelo con il DNA genomico per 5 e 5-MC-HMC quantificazione.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Chin Gyeong, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, laboratorio di Steven E. Jacobsen s, UCLA. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal NIH 1R44GM095209-01.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | ||
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | |||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | ||
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | ||
| molecular biology grade water |
References
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