Alto Rendimiento de medición y clasificación de P orgánico en las muestras ambientales

1. Extracción de fósforo Prepare una solución de 1 litro de 0,25 M de hidróxido sódico (NaOH, 40,00 g / mol) + 0,05 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 292,24 g / mol). Añadir 30 ml de la solución de NaOH + EDTA a 2 g de suelo húmedo o seco / muestra en un tubo cónico de 50 ml. Incubar con agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. Centrífuga 3000 xg durante 3 minutos. 2. Extracto de la muestra de ajuste de pH Transferir una alícuota de 0,1 ml a 1,5 ml un micro-tubo de centrífuga. Añadir 0,017 ml de 2,5 M de ácido acético, 0,144 ml de solución tampón de acetato 0,4 M (70,5% de acetato de sodio [CH3COONa, 82,03 g / mol] y el 29,5% de ácido acético, pH 5,0), y 0.739 ml de agua destilada. El volumen final del extracto de ajuste será de 1 mL y el pH final será 5,0. 3. Foto enzima preparación de la solución Prepare 1 litro de acetato de sodio 0,1 M (CH3COONa, 82,03 g / mol) solución, pH 5,0. Prepare 2 x 10 ml de ácido soluciones madre fosfatasa en el buffer de acetato de sodio preparado en el paso 3.1 de tal manera que las concentraciones finales son cada 0,5 unidades / ml. Fosfatasa ácida de tipo I de Triticum aestivum (germen de trigo, GP, por lo general 0,5 U mg-1 sólido, EC 3.1.3.2) La fosfatasa ácida Tipo IV-S de Solanum tuberosum (papa, PP, en general, 4,6 U mg-1 sólido, EC 3.1.3.2) * Las unidades de actividad son especificados por el proveedor, donde se define una unidad como la liberación de un micromol de ortofosfato para la solución por hora a 37 ° C. Reconstituir liofilizado nucleasa P1 (CE 3.1.30.1) de Penicillium citrinum (hongos, NP1, generalmente de 500 U mg -1 sólido) en un ml de agua desionizada, esto ahora se puede almacenar a 4 ° C para su uso futuro. Pipeta NP1 en uno de los tubos de 10 ml preparada en la etapa 3.2 de tal manera que la concentración final es de 2,5 unidades / mL NP1, mezclar suavemente invirtiendo varias veces. Centrifugar las dos soluciones de la enzima 10 ml 3000 xg durante 30 minutos. 4. P curva de calibración y controles Prepare 1 L de 1 mM fosfato de potasio (K2HPO4, 174,18 g / mol) solución de reserva. Añadir 1 ml de la 1 mM de potasio solución de reserva de fosfato a un tubo centrífugo de 1,5 ml y llevar a cabo siete diluciones seriadas 0,5 ml. Desechar el tubo primero por lo que tiene 7 diluciones que van de 20 nmol, 0,625 nmol P. Transferencia de 80 l de cada tubo por duplicado a las filas de B – H de una placa estándar de 96 pocillos. Añadir 80 l de tampón de acetato de sodio (punto 3.1) de la fila A de las columnas 11 y 12, este es el punto de calibración 0 nmol P. Cada columna 11 y 12 ahora contiene 8 muestras de referencia de 0 a 20 nmol nmol de fosfato inorgánico. En la columna 10 contendrá los siguientes controles: Añadir 40μL PP + solución de la enzima GP + 40 l tampón acetato de sodio (punto 3.1) a los tres primeros pozos en la columna 10. Añadir 40 l PP + GP + NP1 solución de la enzima de búfer + 40 l de acetato de sodio para los próximos tres pozos. Añadir 40 l solución de acetato de sodio con 10 nmol de glucosa-6 fosfato (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • xH 2 O, 304,1 g / mol) + 40 l PP + solución de la enzima GP a un pozo y al final, así en la columna 10, añadir la solución de acetato de sodio en lugar de solución de enzima. 5. + Muestra la enzima de incubación Cada muestra se está probando que ocupan los primeros nueve pozos en una fila de una placa estándar de 96 pocillos. Distribución de 40 L de extractos de la muestra de pH ajustado de la Sección 2 de los pozos de 1-9 en un máximo de 8 líneas. Después de todas las muestras han sido distribuidos * utilizar una pipeta multicanal para distribuir PP + solución de la enzima GP de columnas 1-3, PP + GP + NP1 a las columnas 4-6 y tampón de acetato sódico (preparado en la sección 3.1) a las columnas 7-9. * Este paso debe realizarse con rapidez para asegurar todas las muestras de obtener el tiempo de incubación equivalente. Cubrir la placa de 96 pozos con una tapa y las muestras se incuban + soluciones enzimáticas, los controles y la curva de calibración exactamente 1 hora a 37 ° C. 6. Medición colorimétrica de Lanzamiento y P de fondo inorgánicos Prepare 50 ml de cada una de las siguientes soluciones en agua destilada: Solución A *: 0,1 M de ácido ascórbico (C6H8O6, 176,12 g / mol) + ácido tricloroacético 0,5 M (Cl3, CCOOH, 163,39 g / mol) Solución B: 0,01 M molibdato de amonio ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol) Solución C: 0,1 M de citrato de sodio (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0,2 M arseniato de sodio (NaAsO2, 129,91 g / mol) + 5% de ácido acético glacial (CH3CO2H, 60,05 g / mol) * Solución A debe prepararse diariamente. Añadir 25 l de solución de SDS, 100 l de solución A, 20 L de la solución B y 50 l de C y la solución a todos los pozos de la pl de 96 pozoscomió. Hacer esto rápidamente con una pipeta multicanal. Cubrir la placa e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Medir la absorbancia a 850 nm en un micro-ajustable lector de placas. 7. Clasificación de los compuestos de P Importar datos en bruto en una hoja de cálculo (por ejemplo Microsoft Excel). Trazar la curva de calibración de fósforo inorgánico: 0 a 40 nmol P sobre el eje X y la media de las mediciones de absorbancia por duplicado en el eje. Realizar una regresión lineal y encontrar la ecuación de la recta de mejor ajuste. Columnas 1-3: se aplica directamente la curva de calibración de fondo-esto es inorgánico P. Columnas 4-6: Los valores medios de la muestra por triplicado y restar a los controles (P + enzima solución de fondo inorgánicos) del ingreso bruto absorción, esto es derivado de P hidrolizables monoésteres P. Columnas 7-9: Lo mismo que 7.5, excepto los valores de absorbancia resta de las columnas 4-6 – esto es P desde hidrolizables diésteres P. Convertir los datos de absorbancia en nmol P liberado mediante la aplicación de la ecuación de calibración. nmol P liberado puede relacionarse a mg P / kg de suelo original. Por otra parte, la evaluación de las proporciones de cada clase de P también puede ser un enfoque útil para el análisis de datos. 8. Los resultados representativos: Una rápida inspección visual de la placa de 96 pozos después de la química colorimétrica ofrecerá pistas sobre si el procedimiento se realizó correctamente. La primera cosa a comprobar es el nivel de líquido en cada pozo de exploración del perfil lateral de la placa. No debe ser exactamente 275 l de reactivos en todos los pozos. A continuación, inspeccione visualmente el color de los pozos de la muestra por triplicado y duplicado los pozos de calibración. Estas técnicas se debe repetir el mismo tono de azul. A continuación, aplicar la curva de calibración de los dos pozos que contienen glucosa-6-fosfato y verificar que todos los liberados nmol 10 de inorgánicos P. Después de P total extraído se ha medido mediante ICP-OES o un método alternativo, asegúrese de que el P total de los valores calculados utilizando este protocolo no superen la cantidad de P que se extrajo. Nota: una cuidadosa gestión de los datos en la hoja de cálculo le ayudará a evitar errores cuantitativos. Usted tendrá que lidiar con un montón de números a la vez, creando así una plantilla será tiempo bien invertido. Figura 1. Una placa de 96 pozos que muestra los resultados de 8 muestras (filas AH) y una curva de calibración (columnas 11 y 12). Los controles están en la columna 10. Aumentar la intensidad de color entre las columnas 1-3 y 4-6 se debe a los compuestos hidrolizados monoéster P, entre las columnas 4-6 y 7-9 se debe a los compuestos hidrolizados diéster P. Figura 2. Distribución de las clases de P en un 0,25 M de NaOH 0,05 M de EDTA de extraer una muestra de suelo Vermont con alto rendimiento de la hidrólisis enzimática. Las barras de error indican la desviación estándar, n = 3.