High-Throughput misurazione e classificazione di P organici in campioni ambientali

1. Estrazione del fosforo Preparare una soluzione di 1 litro di 0,25 M di idrossido di sodio (NaOH, 40,00 g / mol) + 0.05 M Etilendiammintetraacetato (EDTA, 292,24 g / mol). Aggiungere 30 ml della soluzione di NaOH + EDTA a 2 g di terreno umido o secco / campione in una provetta da 50 ml. Incubare con agitazione per 16 ore a temperatura ambiente. Centrifuga 3000 xg per 3 minuti. 2. Campione estratto di regolazione del pH Trasferire una aliquota 0,1 ml ad un mL 1,5 micro-tubo di centrifuga. Aggiungere 0,017 ml di 2,5 M di acido acetico, 0,144 ml di tampone acetato 0,4 M (70,5% di acetato di sodio [CH 3 COONa, 82,03 g / mol] e il 29,5% di acido acetico, pH 5,0), e 0,739 ml di acqua deionizzata. Il volume finale dell'estratto regolata sarà di 1 ml e il pH finale sarà 5.0. 3. Enzima Archivi Preparazione soluzione Preparare 1 L di 0,1 M di sodio acetato (CH 3 COONa, 82,03 g / mol) soluzione, pH 5.0. Preparare 2 x 10 ml di acido soluzioni stock fosfatasi nel buffer di acetato di sodio preparato al passo 3,1 tale che le concentrazioni finali sono ogni 0,5 unità / mL. Fosfatasi acida tipo I da Triticum aestivum (germe di grano, medico di famiglia, in genere 0,5 U mg-1 solido, EC 3.1.3.2) Fosfatasi acida Tipo IV-S da Solanum tuberosum (patata, PP, in genere 4,6 mg di U-1 solido, EC 3.1.3.2) * Le unità di attività sono specificati dal fornitore in cui è definito 1 unità come la liberazione di 1 microgrammo di ortofosfato alla soluzione per ora a 37 ° C. Ricostituire il liofilizzato nucleasi P1 (CE 3.1.30.1) da Penicillium citrinum (funghi; NP1, in genere 500 U -1 mg solido) in un ml di acqua deionizzata, questo può essere conservato a 4 ° C per un uso futuro. Pipettare NP1 in uno dei 10 mL preparato in punto 3.2 in modo che la concentrazione finale è di 2,5 unità / mL NP1, mescolare delicatamente, agitando parecchie volte. Centrifugare il 3000 xg due 10 ml di soluzioni di enzimi per 30 minuti. 4. P curva di calibrazione e controlli Preparare 1 L di 1 mM fosfato di potassio (K2HPO4, 174,18 g / mol), soluzione madre. Aggiungere 1 mL di soluzione 1 mM fosfato di potassio magazzino in una provetta da centrifuga da 1,5 ml ed eseguire sette 0,5 ml di diluizioni seriali. Scartare il primo tubo in modo da avere 7 diluizioni che vanno da 20 nmol-0,625 nmol P. Trasferire 80 microlitri di ogni tubo in duplice copia alle righe B – H di una piastra standard da 96 pozzetti. Aggiungere 80 ml di tampone acetato di sodio (sezione 3.1) alla riga A delle colonne 11 e 12-questo è il punto 0 nmol calibrazione P. Ogni colonna 11 e 12 contiene ora 8 campioni di riferimento da 0 a 20 nmol nmol fosfato inorganico. Colonna 10 conterrà i seguenti controlli: Aggiungi 40μL PP + soluzione enzimatica GP + 40 microlitri di buffer acetato di sodio (punto 3.1) ai primi tre pozzi nella colonna 10. Aggiungere 40 microlitri PP + GP + NP1 soluzione enzimatica + 40 microlitri di tampone acetato di sodio per i prossimi tre pozzi. Aggiungere 40 microlitri soluzione di acetato di sodio contenente 10 nmol glucosio-6 fosfato (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • xH 2 O, 304,1 g / mol) + 40 microlitri PP + soluzione enzimatica GP ad un pozzetto e al bene finale nella colonna 10 aggiungere soluzione di acetato di sodio, invece di soluzione enzimatica. 5. Campione + Enzima Incubazione Ogni campione in fase di sperimentazione occuperà i primi 9 pozzi in 1 riga di una piastra standard da 96 pozzetti. Distribuire 40 ml di pH modificato estratti di campione dalla sezione 2 a 1-9 nel pozzi fino a 8 righe. Dopo che tutti i campioni sono stati distribuiti * utilizzare una pipetta multicanale per distribuire PP + soluzione enzimatica GP alle colonne 1-3, PP + GP + NP1 alle colonne 4-6 e tampone acetato di sodio (preparato in sezione 3.1) alle colonne 7-9. * Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente per assicurare tutti i campioni di ottenere il tempo equivalente di incubazione. Coprire la piastra a 96 pozzetti con un coperchio e incubare campioni + soluzioni enzima, i controlli e la curva di calibrazione esattamente 1 ora a 37 ° C. 6. Misurazione colorimetrica di Released e P sfondo inorganici Preparare 50 ml di ciascuna delle seguenti soluzioni in acqua deionizzata: Soluzione A *: 0,1 M acido ascorbico (C6H8O6, 176,12 g / mol) + 0,5 M acido tricloroacetico (Cl3CCOOH, 163,39 g / mol) Soluzione B: 0,01 M molibdato di ammonio ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol) Soluzione C: 0,1 M di sodio citrato (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0,2 arseniato di sodio M (NaAsO2, 129,91 g / mol) + 5% di acido acetico glaciale (CH3CO2H, 60,05 g / mol) * Una soluzione deve essere preparata ogni giorno. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di SDS, 100 ml di soluzione A, 20 ml di soluzione B e 50 microlitri e di C soluzione a tutti i pozzetti della 96-ben plmangiò. Farlo rapidamente con una pipetta multicanale. Coprire la piastra ed incubare 30 minuti a temperatura ambiente. Misurare l'assorbanza a 850 nm, in ogni sintonizzabile micro-placca lettore. 7. Classificazione dei composti P Importare dati in un foglio di calcolo (ad esempio Microsoft Excel). Tracciare la curva di calibrazione inorganici del fosforo: da 0 a 40 P nmol sulle ascisse e la media delle misurazioni dell'assorbanza duplicati l'asse y. Effettuare una regressione lineare e trovare l'equazione della retta di regressione. Colonne 1-3: Direttamente applicare la curva di calibrazione, questo è sfondo inorganico P. Colonne 4-6: Valori medi del campione triplice copia e sottrarre i controlli (enzima soluzione + P inorganico sfondo) da lordo assorbanza-P questo è derivato da idrolizzabili monoesteri P. Colonne 7-9: Stesse 7,5 tranne i valori di assorbanza sottrarre colonne 4-6 – questo è P da idrolizzabili diesteri P. Convertire i dati di assorbanza a nmol P rilasciati applicando l'equazione di taratura. nmol P rilasciato può essere correlato indietro mg P / kg di suolo originale. In alternativa, valutando le proporzioni di ciascuna classe P può anche essere un approccio utile per analizzare i dati. 8. Rappresentante dei risultati: Una rapida ispezione visiva della piastra a 96 pozzetti, dopo la chimica colorimetrica offrirà indizi o meno la procedura è stata eseguita correttamente. La prima cosa da controllare è il livello del liquido in ogni pozzetto una scansione del profilo laterale della piastra. Ci dovrebbe essere esattamente 275 ml di reagenti in tutti i pozzetti. Avanti, ispezionare visivamente il colore dei pozzi campione triplice copia e pozzetti di calibrazione. Questi replicano tecnico dovrebbe essere la stessa tonalità di blu. Avanti applicare la curva di calibrazione per i due pozzetti contenenti glucosio-6 fosfato e verificare hanno liberato tutti i 10 nmol di inorganici P. Dopo P totale estratto è stato misurato in ICP-OES o un metodo alternativo, assicurarsi che la P totale valori calcolati utilizzando questa protocollo non superano la quantità di P che è stato estratto. Nota: attenta gestione dei dati nel foglio di calcolo aiuterà guardia contro gli errori quantitativi. Avrete a che fare con un sacco di numeri in una volta, in modo da creare un modello sarà tempo ben speso. Figura 1. Un piatto da 96 pozzetti mostrando risultati per 8 campioni (righe AH) e una curva di calibrazione (colonne 11 e 12). I controlli sono nella colonna 10. Aumentare l'intensità del colore tra le colonne 1-3 e 4-6 è dovuto al idrolizzato monoestere composti P, tra le colonne 4-6 e 7-9 è dovuto ai composti idrolizzato P diestere. Figura 2. Distribuzione delle classi di P in una 0,25 M NaOH-EDTA 0,05 M di estrarre un campione di suolo Vermont con elevato throughput idrolisi enzimatica. Le barre di errore indicano la deviazione standard, n = 3.