Высокая пропускная измерения и классификации органических P в пробах окружающей среды

1. Фосфор Добыча Подготовка 1L решения 0,25 М раствора гидроксида натрия (NaOH, 40,00 г / моль) + 0,05 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 292,24 г / моль). Добавить 30 мл NaOH + раствором ЭДТА до 2 г влажной или сухой почвы / образца в 50 мл коническую трубку. Инкубируйте при перемешивании в течение 16 часов при комнатной температуре. Центрифуга 3000 мкг в течение 3 минут. 2. Пример извлечения рН регулировки Передача 0,1 мл аликвоту в 1,5 мл микро-центрифуги трубы. Добавить 0,017 мл 2,5 М уксусной кислоты, 0,144 мл 0,4 М ацетатного буфера (70,5% ацетата натрия [CH 3 COONa, 82,03 г / моль] и 29,5% уксусной кислоты, рН 5,0), и 0,739 мл деионизированной воды. Конечный объем скорректированного экстракт будет 1 мл и окончательное рН будет 5,0. 3. Фермент маточного раствора Подготовка Подготовка 1 л 0,1 М ацетата натрия (CH 3 COONa, 82,03 г / моль) растворе, рН 5,0. Подготовка 2 х 10 мл растворов кислот фосфатазы складе в буфере ацетата натрия, подготовленный в шаге 3,1, что окончательные концентрации каждого 0,5 ед / мл. Кислая фосфатаза типа I с Triticum aestivum (зародыши пшеницы, ГП, как правило, 0,5 мг U-1 твердых, EC 3.1.3.2) Кислая фосфатаза типа IV-S от Solanum tuberosum (картофель, РР, как правило, 4,6 мг U-1 твердых, EC 3.1.3.2) * Единицы активности определяются поставщиком, где 1 единица определяется как освобождение от 1 мкмоль ортофосфат для раствора в час при 37 ° C. Разведите лиофилизированный нуклеазы P1 (ЕС 3.1.30.1) из Penicillium citrinum (грибы; NP1, как правило, 500 U мг -1 твердые) в одном мл деионизированной воды-это теперь можно хранить при температуре 4 ° C для дальнейшего использования. Внесите NP1 в один из 10 мл трубы подготовлен в п. 3.2, что конечная концентрация составляет 2,5 ед / мл NP1; осторожно перемешать путем обращения в несколько раз. Центрифуга двух 10 решений мл фермента 3000 мкг в течение 30 минут. 4. P Кривая калибровки и управления Подготовка 1 л на 1 мМ фосфат калия (К2НРО4, 174,18 г / моль) исходного раствора. Добавить 1 мл 1 мМ маточного раствора калия фосфата 1,5 мл трубки центрифуги и выполнять семь 0,5 мл серийные разведения. Откажитесь от первого трубку так, у вас есть 7 разведений от 20 нмоль-0,625 нмоль П. Передача 80 мкл из каждой пробирки в двух экземплярах на строки B – Н от стандартного 96-луночного планшета. Добавить 80 мкл буферного раствора ацетата натрия (раздел 3.1) к ряду колонн 11 и 12-это 0 нмоль P точки калибровки. В каждом столбце 11 и 12 теперь содержит 8 эталонных образцов от 0 до 20 нмоль нмоль неорганического фосфата. Колонка 10 будет содержать следующие элементы управления: Добавить 40μL ПП + GP раствора фермента + 40 мкл буфера ацетата натрия (раздел 3.1) для первых трех скважин в колонке 10. Добавить 40 мкл ПП + GP + NP1 раствора фермента + 40 мкл буфера ацетата натрия в течение следующих трех скважин. Добавить 40 мкл раствора ацетата натрия, содержащего 10 нмоль глюкозо-6 фосфата (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • хН 2 O, 304,1 г / моль) + 40 мкл ПП + GP фермента решения для одной хорошо, и в финал также в колонке 10 добавить раствор ацетата натрия вместо раствора фермента. 5. Образец + фермент инкубации Каждый образец проходит испытания займут первые 9 скважин в 1 ряд стандартных 96-луночного планшета. Распределить 40 мкл рН с поправкой на экстрактах образцов из раздела 2 к скважинам в 1-9 до 8 строк. После всех образцах были распространены * использовать многоканальную пипетку для распространения ПП + GP раствора фермента в столбцы 1-3, ПП + GP + NP1 в столбцы 4-6 и буферного раствора ацетата натрия (подготовлен в разделе 3.1) в столбцы 7-9. * На этом этапе должны быть выполнены быстро, чтобы заверить всех образцах получить эквивалентное время инкубации. Обложка 96-луночный планшет с крышкой и инкубировать образцы + фермент решений, контроля и калибровочной кривой ровно 1 час при температуре 37 ° C. 6. Колориметрический Измерение выхода и история неорганической P Подготовка 50 мл каждого из следующих решений в деионизованной воде: Решение *: 0,1 М аскорбиновой кислоты (C6H8O6, 176,12 г / моль) + 0,5 М трихлоруксусной кислоты (Cl3CCOOH, 163,39 г / моль) Раствор В: 0,01 M молибдата аммония ((NH4) 2MoO4, 196,01 г / моль) Решение C: 0,1 М цитрат натрия (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 г / моль) + 0,2 М натрия арсенат (NaAsO2, 129,91 г / моль) + 5% ледяной уксусной кислоты (CH3CO2H, 60,05 г / моль) * Решение должно быть готово в день. Добавьте 25 мкл раствора SDS, 100 мкл раствора, 20 мкл Б решение и 50 мкл раствора и C для всех скважин в 96-а плели. Делайте это быстро многоканальную пипетку. Обложка пластинки и инкубировать 30 минут при комнатной температуре. Измерьте оптическую плотность при 850 нм в любом перестраиваемых микро-ридер. 7. Классификация соединений P Импорт исходных данных в электронных таблицах (например, Microsoft Excel). Участок неорганического фосфора калибровочной кривой: от 0 до 40 нмоль P на ось х и среднее дубликатов измерения абсорбции на вертикальной оси. Выполните линейной регрессии и найти уравнение линии наилучшего соответствия. Столбцы 1-3: Непосредственно применять калибровочной кривой-это фон неорганических П. Столбцы 4-6: Средние значения образца трех экземплярах и вычесть из контрольной группы (раствор фермента + P фоне неорганической) от валового абсорбции-это Р основе гидролизуемых моноэфиры P. Столбцы 7-9: То же, за исключением 7,5 вычесть значения абсорбции из столбцов 4-6 – это P из гидролизуемых диэфиры P. Преобразование абсорбции данные нмоль P выпущен с применением калибровочного уравнения. нмоль P выпустили могут быть связаны обратно в мг Р / кг оригинальных почвы. Кроме того, оценка пропорций каждого класса P также может быть полезным подходом для анализа данных. 8. Представитель Результаты: Быстрый визуальный осмотр 96-луночного планшета после колориметрических химии предложит подсказки или нет процедура была выполнена правильно. Первое, что проверка уровня жидкости в каждую лунку при сканировании бокового профиля пластины. Там должно быть ровно 275 мкл реагентов во всех скважинах. Затем осмотрите цвет скважин трех экземплярах образца и дублировать калибровки скважин. Эти технические репликации должна быть такой же оттенок синего. Затем нанесите калибровочной кривой для двух скважин содержащих глюкозо-6 фосфата и убедиться, что они освободили всех 10 нмоль неорганических П. После полного извлечения P была измерена с помощью ICP-OES или альтернативный метод, убедитесь, что общая P значений, рассчитанных с помощью этого Протокол не может превышать сумму P, который был извлечен. Примечание: Тщательное управление данными в электронной таблице поможет защититься от количественных ошибок. Вы будете иметь дело с большим количеством номеров сразу, поэтому создание шаблона будет время хорошо провели. Рисунок 1. 96-луночного планшета Отображение результатов для 8 образцов (строки АГ) и калибровочной кривой (столбцы 11 и 12). Органы управления в колонке 10. Цвет повышение интенсивности между столбцами 1-3 и 4-6 происходит из-за гидролизованный моноэфира P соединений между столбцами 4-6 и 7-9 происходит из-за гидролизованных соединений P эфира. Рисунок 2. Распределение классов П в 0,25 М NaOH-0,05 М ЭДТА экстракт образца почвы Вермонт использованием высокой пропускной ферментативного гидролиза. Ошибка полоски показывают стандартное отклонение, п = 3.