Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

1. Transferência adotiva de células: Veia da cauda ou injeção intra-ocular são métodos adequados para a introdução de células-tracker rotulados ou proteína fluorescente que expressam linfócitos. Neste vídeo. demonstramos transferência adotiva de células por injeção veia da cauda. a. Materiais Células T CD4 + são rotulados com 1,4 mM CFSE por 30 minutos a 37 º C, lavados duas vezes, e re-suspenso em 100 mL de RPMI-1640. Células são carregados em uma seringa de insulina estéreis 28 gauge para injecção. O número de células utilizado depende da experiência que está sendo feito. Normalmente, 5 milhões de células T são suficientes para a visualização de células T simples. Um limitador de roedores para o mouse é necessário para evitar danos ao animal e para si mesmo. b. Protegendo o animal O mouse é garantido para a transferência adotiva por lentamente apoio do animal para o limitador de roedores (ver vídeo) e fechando a extremidade aberta do tubo delicadamente pressionando o êmbolo. Não deixe de ir a cauda do rato durante este processo, como alguns animais de pequeno porte pode virar-se dentro do limitador. Este método evita que o animal de ferir-se e de mover-se durante a injecção. Ao configurar o limitador de roedores, não empurre o êmbolo para dentro mais longe do que é necessário para manter o animal de saltar para a frente. Além disso, não empurre o êmbolo contra o animal, e não deixar o animal no limitador por um período prolongado de tempo. c. Visualização da veia da cauda Puxe o rabo em sua direção para que seja levemente enrolado ao longo do seu dedo indicador e segurou contra o interior do dedo pelo seu polegar. Identificar as veias da cauda localizados em cada lado da cauda na posição vertical. A visualização é facilitada pelo aquecimento da cauda com água morna, em seguida, limpar-se com etanol. d. Injeção de células Quando a veia foi localizada, insira a seringa bisel voltado para cima em um ângulo paralelo rasa para a veia. Uma vez na veia, gentilmente o êmbolo, se você está na veia não deve haver nenhuma resistência à injeção. Se houver resistência, retire a seringa e tente novamente em um local diferente. Se você está na veia, lentamente o êmbolo até que a injeção é completa. A cauda não deve tornar-se distendido durante a injecção. Se isso acontecer, isso significaria que a agulha não está na veia. É possível "perder" a veia durante a injeção. Se isso acontecer, retire a agulha e tentar a sua injeção em um local diferente. Se você precisa tentar mais de uma injeção, o melhor é mover a cauda para cima em direção ao corpo do mouse a partir do local da injeção original. Planejar com antecedência para essa possibilidade, iniciando distalmente na cauda para dar-se espaço para mais uma tentativa de transferência adotiva. e. Pós-injeção considerações Após a injeção for concluída, um pequeno refluxo de sangue da veia irá ocorrer. Pressione suavemente o local da injecção com um limpa-wipe até parar de sangrar. Retire o êmbolo e deixe o animal andar para a frente, fora do limitador, enquanto delicadamente segurando a cauda. Sempre verifique com seu comitê de cuidados com animais e protocolos de uso de animais para garantir que está em conformidade. É importante praticar esta técnica várias vezes antes de tentar a experiência real. 2. Isolamento do Linfonodo Isolamento dos gânglios linfáticos por dois fótons de imagem requer a remoção cuidadosa do linfonodo correta do tecido circundante. a. Seleção e localização de linfonodos periféricos Seleção de linfonodos para imagens vai depender dos objetivos experimentais. Estar ciente de infecção local ou injeção de drenagem dos gânglios linfáticos, e selecione o nó apropriado para imagens. O artigo de Van den Broeck et al., Descreve a localização e morfologia dos gânglios linfáticos murino em detalhe 3. Neste vídeo, demonstramos a excisão de seis grandes linfonodos periféricos, que são adequados para o isolamento de células ou de imagem. b. Remoção dos linfonodos: Tenha em mente a integridade do tecido durante a remoção dos gânglios linfáticos. Tenha cuidado para não romper a cápsula ou em qualquer forma prejudicar a estrutura dos linfonodos. Perda da integridade estrutural de linfonodo irá comprometer o experimento. Se necessário, remover a gordura da superfície linfonodo com finas pinças de dissecação (# 5 Dumont) sob um microscópio de dissecação. Linfonodos não deveria ter qualquer gordura restante na superfície do nó, pois isso irá obscura de imagem por espalhamento da luz. Excisão adequada de linfonodos também é uma técnica importante para a prática antes da primeira experiência real. 3. Nod linfáticose de imagem de instalação e Considerações Linfonodo deve ser assegurada para a fase de imagem, que neste caso consiste em uma câmara embutida. Aquecido, de oxigênio perfundidos mídia é bombeado para a câmara de um lado através de uma bomba peristáltica e aquecedor de inline, e ele sai através de um canal de queda-graduada em uma câmara de coleta com um tubo de vácuo para um balão de recolha de resíduos. No nosso sistema, o linfonodo está submerso em 37 ° C media e super-perfundidos com classe médica carbogênio (5% CO 2, 95% O 2). A temperatura do meio de perfusão deve ser registrada como perto do nó de linfa como é possível. Seu sistema em particular pode exigir variações na taxa de fluxo de mídia e cenografia para acomodar o estágio do microscópio e objetiva. a. Linfáticos configuração de imagem nó: Conforme mostrado no vídeo, que segura o linfonodo pelo primeiro anexá-lo, medular voltada para baixo (para a imagem de T ou células B zonas usando um microscópio vertical) para uma lamela de plástico, cortado no tamanho apropriado. É importante usar uma cola de tecido não-tóxico (usamos VetBond ™ da 3M Corporation). A lamela é garantido na mídia que flui, colocando uma pequena bagatela de graxa de silicone na parte de baixo da lamínula, em seguida, aderir à essa base de vidro da câmara de imagem. b. 2-Photon considerações de imagem: Vários fatores podem causar linfócitos parar de se mover: temperatura muito alta ou muito baixa; potência do laser em excesso; compressão ou outros danos ao nó de linfa, e falta de oxigênio. Danos devido a potência do laser excessiva ou temperaturas> ~ 39 ° C é irreversível. Se as células são fracas, é tipicamente melhor para aumentar o ganho de detector ou o protocolo de células-rotulagem em vez de usar um poder maior de laser para visualizar as células. Otimização de rotulagem ou expressão de proteínas fluorescentes pode ser necessária para trazer a fluorescência acima do nível de autofluorescência de fundo. Com ganho razoável e configurações de energia do laser, uma mudança dois log de fluorescência acima dos valores basais (medido por citometria de fluxo) é razoável para a visualização de células. Sintonizável com dois fótons lasers, o comprimento de onda usado para a excitação deve ser um pouco inferior ao dobro do máximo de excitação o fóton único do fluoróforo sendo fotografada. Em dois fótons experimentos usando mais de um rótulo ou proteína fluorescente pode ser necessário fazer experiências com o comprimento de onda de excitação usada para encontrar os melhores ajustes para ambos os rótulos. Excitação de dois fótons também pode ser usado para estruturas de colágeno endógeno imagem, aproveitando o intrínseco de segunda geração azul harmônica. Geração de segundo harmônico (SHG) ocorre quando dois fótons são combinados dentro de um material e emitir um único fóton de duas vezes a freqüência dos fótons original. Em tecido, de dois fótons de excitação ocorre quando a luz do laser incidente é perpendicular a uma estrutura de proteínas altamente ordenada como o colágeno. Questões práticas a respeito de dois fótons de imagem foram discutidas nas revisões preview 4, 5.