二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の間にリンパ球運動と細胞間相互作用を明らかにした。ここで、我々はT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 +植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入を示しています。
二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の開始時の運動性と細胞間相互作用の優雅な振り付けを明らかにした。ここで、我々は、標識されたT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 + 2002年2で説明したように植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入するための方法を提示する。免疫細胞の二光子励起イメージングは、細胞を蛍光セルトラッカーの色素で染色することによりまたは蛍光タンパク質を発現するかして、ラベル付けされている必要があります。我々は、約15-30分内リンパ器官には、自宅レシピエント動物の尾静脈にドナーマウス由来の細胞を注入するの養子移入の手順を示しています。我々はリンパ節の分離を示し、摘出したリンパ節の実装を適切に確保するための方法を説明します。このような適切な灌流メディアの酸素、温度、およびレーザパワーのような他の考慮事項が説明されています。最後に、我々はナイーブCD4の3D映像+ 37℃で定常状態の運動性を示すT細胞を提示℃に
このビデオプロトコルでは、養子細胞移入と末梢リンパ節のイメージングリンパ球の運動性に必要なリンパ節の分離と準備するための手順を示しています。二光子イメージングには、外植組織(ここに示されている)の両方でと生体製剤における共焦点イメージングに比べていくつかの利点があります。特に、光散乱を最小限に抑え、リンパ節被膜下イメージング〜300マイクロメートルを可能にするといくつかの組織4の深い赤外励起の使用。また、多光子励起は、漂白写真と焦点面の側面から組織の損傷を最小限に抑え、目標の焦点に制限されています。あらゆる新技術と同様に、しかし、二光子イメージングは、万能薬ではないとその限界と潜在的な落とし穴が念頭5に保持する必要があります。興味のコラーゲン細胞を蛍光外因性のプローブによって、または蛍光タンパク質の発現によってラベル付けされている必要がありますがそのような第二高調波発生などの内因性シグナルを除いて – これらの中でその要件です。真実にそれらがに浸漬されているのに対し、構造要素と無数の他のラベルの付いていない、目に見えない細胞の複雑な環境と相互作用し、印象は、このように、これらの標識細胞が黒色無効に泳いでいることが作成されます。
免疫学への二光子イメージングの導入以来6年で、この手法は、直接細胞間相互作用、細胞の運動性と局在、細胞のシグナル伝達経路と細胞傷害性細胞を含む無傷の生体組織のプロセスで視覚化することによって長年の疑問を解決するための研究を可能にしたイベントを殺す。フィールドは急速に初期の現象論的説明を越えて進化している、とコンピュータモデリングとシミュレーションと一緒に定量分析は、現在、リンパ節内で明らかに混沌とした細胞の動きとの相互作用が効率的な免疫応答を導く方法の意味を理解し始めている。この進展は、総合的にimmunoimagingの2光子顕微鏡のアプリケーションを記述する100以上の論文をリスト最近の出版物1に見直される。
我々は、試薬の準備の支援のためにレベッカのPaquetteを感謝します。 MPMは、国立衛生研究所からの補助金からの健康と支援の国立研究所GM – 41514(MDC)、NS – 48252(KGC)、GM – 48071(IP)からルースL. Kirchstein博士号を取得する前のフェローシップでサポートされています。