تشريح و 2 الفوتون التصوير من العقد الليمفاوية الطرفية في الفئران
Summary
وكشف اثنان الفوتون التصوير حركية اللمفاويات والتفاعلات الخلوية داخل العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية خلال استجابة مناعية 1. هنا ، علينا أن نظهر نقل بالتبني من الخلايا التائية ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة التصوير من خلايا CD4 + T في العقدة الليمفاوية explanted.
Abstract
وقد كشف اثنان الفوتون تصويري شامل للالكوريغرافيا أنيقة من حركية والتفاعلات الخلوية في العقدة الليمفاوية في ظل ظروف والقاعدية في بدء استجابة مناعية 1. هنا ، فإننا نقدم طرق لنقل بالتبني من الخلايا التائية المسمى ، والعزلة من العقد الليمفاوية ، والحركة من التصوير خلايا CD4 + T في العقدة الليمفاوية explanted كما هو موضح الأولى في عام 2002 2. التصوير ثنائي الفوتون من الخلايا المناعية التي تتطلب fluorescently المسمى الخلايا ، إما عن طريق تلوين مع خلية الصبغة أو تعقب بالإعراب عن بروتين فلوري. علينا أن نظهر للإجراءات نقل بالتبني من الخلايا المشتقة من حقن الفئران المانحة في الوريد ذيل الحيوان المتلقي ، حيث أنها موطن لأجهزة اللمفاوية ضمن 15-30 دقيقة تقريبا. نوضح العزلة من العقدة الليمفاوية وتصف وسائل لضمان التركيب الصحيح للالعقدة الليمفاوية استئصاله. وتناقش اعتبارات أخرى مثل الأوكسجين المناسب من وسائل الإعلام perfused ودرجة الحرارة وقوة الليزر. وأخيرا ، فإننا نقدم لصور الفيديو 3D CD4 + الخلايا التائية السذاجة العارضة المطرد حركية الدولة في 37 ° C.
Protocol
Discussion
في هذا البروتوكول الفيديو نظهر الإجراءات لنقل الخلايا الليمفاوية بالتبني وعقدة العزلة والتحضير اللازم لمفاوية حركية التصوير في العقدة الليمفاوية الطرفية. ثنائي الفوتون التصوير ديها العديد من المزايا أكثر من التصوير في كل من أنسجة مبائر explanted (كما هو موضح هنا) وintravital في التحضيرات. خصوصا ، واستخدام الأشعة تحت الحمراء يقلل الإثارة تشتت الضوء وتسمح للتصوير ~ 300 ميكرومتر تحت الكبسولة من العقدة الليمفاوية وأعمق في بعض الأنسجة 4. وعلاوة على ذلك ، يقتصر متعدد الفوتون الإثارة إلى النقطة المحورية لهذا الهدف ، وتبيض الصورة تقليل تلف الأنسجة من جانب الطائرة التنسيق. كما هو الحال مع أي تقنية جديدة ، ومع ذلك ، واثنين من الفوتون التصوير ليست حلا سحريا ، ويجب أن تبقى حدودها والمزالق المحتملة في الاعتبار 5. بين هذه هو شرط ذلك — باستثناء اشارات الجوهرية مثل الجيل الثاني التوافقي بواسطة خلايا الكولاجين الفائدة يجب أن تكون التحقيقات التي fluorescently المسمى خارجي أو من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية. وبالتالي يتم إنشاء الانطباع بأن هذه الخلايا هي المسمى السباحة في فراغ أسود ، بينما في الحقيقة هي أنها منغمسة في ، والتفاعل مع بيئة معقدة من العناصر الهيكلية وغيرها غير المسماة لا تعد ولا تحصى ، والخلايا غير مرئية.
في السنوات الست منذ بدء اثنين من الفوتون التصوير لالمناعة ، وسمحت هذه التقنية الباحثين لمعالجة طويلة الأمد الأسئلة التي تصور بشكل مباشر في سلامة الأنسجة الحية بما في ذلك عمليات الخلية خلية التفاعلات ، وحركية الخلية والتوطين ، مما يشير مسارات الخلوية السامة للخلايا والخلية مقتل الأحداث. وقد تطورت بسرعة تتجاوز مجال توصيف الظواهر الأولية ، والتحليل الكمي مع النمذجة والمحاكاة الكمبيوتر بدأت الآن لفهم كيف أن الحركات الفوضوية يبدو الخلوية والتفاعلات داخل الغدد الليمفاوية يؤدي إلى استجابة مناعية فعالة. ويتم استعراض شامل هذا التقدم في منشور صدر مؤخرا 1 ، الذي يسرد ما يزيد على 100 ورقات واصفا طلب من اثنين من الفوتون المجهري للimmunoimaging.
Acknowledgements
نود أن نشكر ريبيكا باكيت للمساعدة في تحضير كاشف. معتمد من قبل MPM زمالة روث Kirchstein L. predoctoral من المعاهد الوطنية للصحة ودعم من المنح GM – 41514 (MDC) ، NS – 48252 (KGC) ، GM – 48071 (IP) أيضا من المعاهد الوطنية للصحة.
References
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol. Annu Rev Immunol. , (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
