NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

1. Microvolume Quantificação de Ácido Nucleico Usando um NanoDrop 2000c Espectrofotômetro Para começar, limpar as superfícies superior e inferior óptica do sistema de retenção microvolume espectrofotômetro amostra pipetando 2-3 mL de água deionizada para limpar a superfície inferior óptica. Fechar o braço de alavanca, garantindo que o pedestal superior entra em contato com a água deionizada. Levante o braço de alavanca e limpe ambas as superfícies ópticas com um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório. Abra o software NanoDrop e selecione o aplicativo de ácido nucléico. Use um volume pequeno, pipetador calibrado para realizar uma medição em branco, dispensa 1 mL de tampão para a superfície inferior óptica. Abaixe o braço de alavanca e selecione "branco" na aplicação de ácido nucléico. Uma vez que a medição em branco é completa, limpa ambas as superfícies ópticas com um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório. Escolha a constante apropriada para o exemplo que está a ser medido. Tipo de amostra Selecione Opção Constante Utilizado para Calcular Concentração dsDNA DNA-50 50 ssDNA DNA-33 33 RNA RNA-40 40 Oligo Personalizado 15-150 Tabela 1. Típicos varia de ácido nucléico de concentração para as medidas de absorbância direta A280 usando um NanoDrop microvolume espectrofotômetro, um espectrofotômetro cuvete tradicional baseado usado com uma microcélula TrayCell cuvete, e um fluorospectrometer NanoDrop microvolume em conjunto com o ensaio PicoGreen. Dispense 1 mL de amostra de ácido nucléico para o pedestal inferior ópticas e fechar o braço de alavanca. Porque a medida é de volume independente, a amostra só precisa preencher a lacuna entre as duas superfícies ópticas para uma medição a ser feita. Selecione "Measure" no software de aplicação. O software irá calcular automaticamente as taxas de ácido nucléico concentração e pureza. Após medição da amostra, analisar a saída espectral. O software irá calcular automaticamente as taxas de ácido nucléico concentração e pureza. Após medição da amostra, rever a imagem espectral para avaliar a qualidade da amostra. Uma amostra de ácido nucleico típico terá um perfil muito característico. Figura 1. Uma amostra de ácido nucleico típico terá um perfil muito característico. As fontes comuns de contaminantes específicos associados com técnicas de isolamento de ácido nucléico incluem a extração de fenol / Trizol e coluna. No caso da extração de fenol / Trizol, a contaminação do reagente residual pode ser indicado por espectros anormal entre 220-240 nm, bem como por mudanças na região 260-280 nm. Por outro lado, guanidina residual da extração de coluna podem contribuir para um pico próximo 230 nm e uma mudança no cocho de 230 nm a cerca de 240 nm. Figura 2. As mudanças nos picos e depressões das amostras B e C, em comparação com amostra A ilustrar como contaminantes podem afetar os espectros de amostras de ácidos nucléicos. Para avaliar com precisão a qualidade da amostra, 260/280 ou 260/230 índices deveriam ser analisados ​​em combinação com qualidade espectral global. Pure ácidos nucléicos normalmente produzem uma relação de 260 / 280 ~ 1,8 e uma relação de 260/280 de ~ 2.0 para DNA e RNA, respectivamente. Esta relação é dependente do pH e força iônica do buffer usado para fazer o branco e as medições da amostra. Soluções ácidas será sub-representação da relação por 0,2-0,3, enquanto uma solução básica sobre-representam a razão por 0,2-0,3. Relações pureza significativamente diferentes podem indicar a presença de proteínas, fenol ou outros contaminantes que absorvem fortemente em ou perto de 280 nm. O grau de pureza de 260/230 é uma segunda medida de pureza do DNA com os valores de um ácido nucléico "puro" em geral na faixa de 1,8-2,2. Relações pureza que são significativamente inferiores aos valores esperados podem indicar a técnica de isolamento utilizado pode exigir maior otimização. Espectrofotômetros NanoDrop também podem ser usados ​​para quantificar proteínas usando absorbância direta ou por ensaios de proteína colorimétrico. Para garantir a formação adequada coluna e reprodutibilidade, 2 mL amostras são aconselhados para as amostras de proteína. Consulte o vídeo JOVE seguinte: Microvolume determinação da concentração de proteínas usando o espectrofotômetro NanoDrop http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610 <p class = "jove_title"> 2. Alta Sensibilidade Microvolume Quantificação de Ácido Nucleico Usando o Fluorospectrometer 3300 NanoDrop Para demonstrar a alta sensibilidade microvolume quantificação de ácidos nucléicos usando o 3300 NanoDrop, um kit PicoGreen fluorescência é usada. Para começar, equilibrar os padrões do kit e todas as amostras de ácido nucléico à temperatura ambiente. Amostras fluorescentes são sensíveis à luz e deve ser mantido em âmbar ou envolto tubos de alumínio. Prepare o suficiente 1x tampão TE para todos os padrões e amostras a serem medidos, bem como para a solução PicoGreen de trabalho que serão necessários. Prepare tampão 1xTE diluindo fornecidas 20x tampão TE com água livre de nuclease por protocolo do fabricante. Volumes de reação pode variar de 200 mL para menos de 10 ul. Neste exemplo, 10 volumes de reação mL será preparado. Prepare série padrão diluídas dsDNA em 2X a concentração final desejada em nuclease livre de frascos ou tubos. Transferir 5 mL de cada um dos padrões dsDNA diluído em um indivíduo rotulado nuclease livre de âmbar ou cobertos de folha de tubo. ML alíquota 5 de cada amostra de interesse em dsDNA devidamente rotulados âmbar nuclease-free ou folhas cobertas de tubos. Prepare PicoGreen solução de trabalho de acordo com o protocolo do fabricante. Transferência de um volume igual de solução PicoGreen trabalhando a cada tubo contendo um padrão ou amostra de interesse (5 mL, neste exemplo). Combine volumes iguais de 1x tampão TE e solução PicoGreen de trabalho para preparar o controle negativo, que serve como uma solução de referência. Misture o conteúdo de cada tubo de reacção completamente pipetando suave e incubar as reações à temperatura ambiente por 5 minutos. Todos os padrões e as amostras devem ser equilibrados à mesma temperatura antes da medição como sinal de fluorescência é afetado pela temperatura. Para preparar o instrumento e efectuar medições, primeiro limpe as superfícies inferior e superior do sistema de retenção de amostra. Pipete 2-3 de água deionizada para a menor superfície óptica, feche em seguida, abra o braço de alavanca, e secar os pedestais superior e inferior com um pano limpo, sem fiapos, limpe laboratório. Assegurar as superfícies são livres de fiapos antes de prosseguir como fiapos podem apresentar fluorescência na presença de uma fonte de excitação e pode interferir com a medição. Abra o software do aparelho, selecione a opção "ácidos nucléicos", aplicação e selecione a opção "PicoGreen-dsDNA" opção. Para o instrumento em branco, adicionar 2 mL de TE 1x ao menor pedestal, perto do braço, e selecione "Blank" no campo de software instrumento. Uma vez em branco é completa, limpe a solução em branco de ambas as superfícies do sistema de retenção de amostra. Misturar a solução de referência por pipetagem suave. Usando dicas de retenção baixa, pipeta mL 2 sobre o pedestal inferior e fechar o braço. Selecione "referência" no tipo de medição, e selecione as unidades desejadas. Clique em "Measure" para iniciar o ciclo de medição. Quando o ciclo de medição estiver completo, abra o braço e completamente fora da amostra blot superfícies do sistema de retenção. Medir até cinco repetições de referência, utilizando uma nova porção para cada repetição. Repita o processo para as normas complementares para construir uma curva padrão. Até sete padrões podem ser usados. O software é projetado para armazenar até cinco repetições para cada padrão. Replica das normas são em média para gerar uma curva padrão a partir do qual as concentrações da amostra são determinados automaticamente. Uma vez que a curva padrão é completo, selecione a opção "Samples" guia, insira as informações ID respectivos amostra e medir cada amostra desconhecida.