NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren
Summary
Het gebruik van NanoDrop microvolume systemen als praktische en efficiënte alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode wordt beschreven door de demonstratie van twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen.
Abstract
Biomoleculaire tests worden voortdurend ontwikkeld, die gebruik maken van steeds kleinere hoeveelheden materiaal, vaak zich verzet tegen het gebruik van conventionele kuvet-gebaseerde instrumenten voor nucleïnezuur kwantificering voor degenen die microvolume kwantificatie kan uitvoeren.
De NanoDrop microvolume monster retentie systeem (Thermo Scientific NanoDrop Products) functies door de combinatie van glasvezel technologie en natuurlijke oppervlaktespanning eigenschappen vast te leggen en te behouden minieme hoeveelheden van het monster los van de traditionele containment apparaten zoals cuvettes of haarvaten. Bovendien is het systeem maakt gebruik van kortere weglengte, die resulteren in een breed scala aan nucleïnezuur concentratiemetingen in wezen waardoor de noodzaak om verdunningen uit te voeren. Vermindering van het volume van het monster nodig voor spectroscopische analyse ook vergemakkelijkt de opname van extra kwaliteitscontrole stappen heel veel moleculaire workflows, het verhogen van de efficiëntie en uiteindelijk leidt tot meer vertrouwen in downstream resultaten.
De noodzaak voor hoge gevoeligheid fluorescerende analyse van de beperkte massa is ook naar voren gekomen met de recente experimentele ontwikkelingen. Met dezelfde microvolume monster retentie-technologie, kan TL-metingen worden uitgevoerd met 2 pl van materiaal, waardoor tl-assays volume eisen aanzienlijk worden verminderd. Dergelijke microreactions van 10 pi of minder zijn nu mogelijk met behulp van een speciale microvolume fluorospectrometer.
Twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen zal worden aangetoond dat het gebruik geïntegreerde monster retentie systemen als praktische alternatieven voor de traditionele kuvet-gebaseerde protocollen. Eerst wordt een directe A260 absorptie methode met behulp van een spectrofotometer microvolume beschreven. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van een fluorescentie-gebaseerde methode die minder volume fluorescentie reacties mogelijk maakt met een microvolume fluorospectrometer. Deze nieuwe technieken kunnen worden beoordeeld van nucleïnezuur concentraties variërend van 1 pg / ul tot 15.000 ng / ul met een minimaal verbruik van het monster.
Protocol
Discussion
De kwantificatie protocollen hier zijn gebaseerd op de meest geaccepteerde microvolume systemen. Dergelijke systemen bieden praktische alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode, die afhankelijk zijn van een grotere steekproef volumes en het gebruik van containment apparatuur.
NanoDrop microvolume technologie maakt gebruik van een sample retentie systeem dat is gebaseerd op de oppervlaktespanning eigenschappen van het monster wordt gemeten tot een vloeistofkolom vorm. Het is essentieel dat de steekproef contact maakt met de bovenste en onderste optische meting oppervlakken voor een goede column vorming. Als op enig moment van de meetresultaten lijken onjuiste of niet reproduceerbaar, het is waarschijnlijk het resultaat van de steekproef heterogeniteit of vloeibare kolom breuk.
Wasmiddelen en isopropyl alcohol worden niet aanbevolen schoonmaakmiddelen want deze kunnen deconditioneren het voetstuk meting oppervlakken. Een onvoorwaardelijke voetstuk treedt op wanneer de hydrofobe oppervlakte-eigenschappen van de sokkel zijn aangetast, wat resulteert in een afvlakking van het monster druppel. Ongeconditioneerde voetstukken kan leiden tot breuk van de vloeistof kolom tijdens de meting.
Figuur 3. Ongeconditioneerd oppervlak wordt gekenmerkt door een afvlakking van een waterdruppel.
Uncondtioned voetstuk oppervlakken kunnen worden gereconditioneerd met behulp van NanoDrop Pedestal Reconditionering Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Een dunne laag van reconditionering verbinding wordt toegepast op de bovenste en onderste voetstuk oppervlakken, laten drogen voor ~ 30 seconden, daarna wreef uitschakelen met behulp van een schone, droge, pluisvrije lab te vegen. Een succesvol gereviseerde toestand wordt gekenmerkt door een waterdruppel parelen wanneer toegepast op de bodem voetstuk oppervlak.
Figuur 4. Een gereviseerde oppervlak wordt gekenmerkt door een kralen van een waterdruppel.
Microvolume kwantificatie systemen sterk verminderen monster verbruik en drastisch verhogen de concentratie range in vergelijking met meer traditionele kwantificering systemen. Hoewel microvolume kwantificatie vaak uitgegroeid tot een enabling technology voor omstandigheden met betrekking tot beperkte celmassa, zoals de naald biopsieën en laser-capture microdissectie, de efficiëntie en gemak van het gebruik van deze methodologie heeft ervoor gezorgd dat een algemeen aanvaarde alternatief voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode zelfs wanneer monster is er in overvloed.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Richard W. Beringer en David L. Ash, Applications Wetenschappers, Thermo Scientific NanoDrop producten, voor technische bijstand en filmen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | ||
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific | ND-3300 |
References
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
- Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. , (2006).
- Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. . Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).
- Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).
