NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

1. Microvolume כימות חומצות גרעין שימוש 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר כדי להתחיל, לנקות את המשטחים אופטי העליון והתחתון של מערכת מדגם ספקטרופוטומטר microvolume השמירה על ידי pipetting 2-3 μL deionized מים נקיים על פני השטח אופטי נמוך. סגור את זרוע המנוף, על מנת להבטיח כי הדום העליון בא במגע עם המים deionized. הרם את זרוע המנוף לנגב הן משטחים אופטיים עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. פתח את תוכנת NanoDrop ובחר ביישום חומצות גרעין. השתמש נפח קטן, pipettor מכויל לבצע מדידה ריק על ידי מחלק 1 μL של המאגר על גבי משטח אופטי נמוך. מנמיכים את זרוע המנוף בחר "ריק" ביישום חומצות גרעין. לאחר המדידה ריק תושלם, גם משטחים נקיים אופטי עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. בחר את קבוע מתאים המדגם זה כדי להימדד. לדוגמה סוג בחר אפשרות קבועים המשמשים לחישוב ריכוז dsDNA DNA-50 50 ssDNA DNA-33 33 RNA RNA-40 40 אוליגו מנהג 15-150 טבלה 1. אופיינית ריכוז חומצת גרעין טווחי עבור A280 מדידות ישירות באמצעות ספיגת NanoDrop microvolume ספקטרופוטומטר, ספקטרופוטומטר קובט מסורתיים מבוססי המשמשים עם microcell TrayCell קובט, וכן fluorospectrometer NanoDrop microvolume בשיתוף עם assay PicoGreen. לוותר על 1 μL המדגם חומצות גרעין על הכן אופטי נמוך ולסגור את זרוע המנוף. כי המדידה היא בנפח עצמאית, המדגם צריך רק כדי לגשר על הפער בין שני משטחים אופטיים עבור המדידה להתבצע. בחר "מדוד" תוכנת היישום. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את הפלט רפאים. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את התמונה ספקטרלי כדי להעריך את איכות המדגם. דוגמה טיפוסית חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. באיור 1. מדגם טיפוסי חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. מקורות נפוצים של מזהמים הקשורים ספציפית טכניקות בידוד גרעין חומצה כוללים להפקת פנול / Trizol ועמודה. במקרה של מיצוי פנול / Trizol, זיהום מגיב השיורי עשוי להיות מסומן על ידי ספקטרום נורמלי בין 220-240 ננומטר, כמו גם על ידי משמרות באזור 260-280 ננומטר. לעומת זאת, guanidine שיורית מתוך מיצוי טור עשויים לתרום שיא ליד 230 ננומטר שינוי השוקת מ 230 ננומטר של כ 240 ננומטר. איור 2. המשמרות את העליות והמורדות של דגימות B ו-C לעומת מדגם להמחיש כיצד מזהמים יכולים להשפיע על ספקטרום של דגימות חומצות גרעין. כדי להעריך נכונה איכות המדגם, 260/280 או 260/230 יחס צריך להיות מנותח בשילוב עם איכות רפאים הכולל. חומצות גרעין טהור בדרך כלל תשואה יחס של 260/280 ~ 1.8 ו 260/280 יחס של 2.0 ~ עבור DNA ו-RNA, בהתאמה. יחס זה תלוי pH וחוזק היוני של המאגר המשמש לייצור הריק ומדידות במדגם. פתרונות חומציים יהיה מתחת מייצגים את היחס של 0.2-0.3, ואילו הפתרון הבסיסי יהיה מעל מייצגים את היחס של 0.2-0.3. יחסי טוהר שונה באופן משמעותי עלול להעיד על נוכחות של מזהמים חלבון פנול או אחרים לספוג חזק ליד או 280 ננומטר. יחס 260/230 טוהר הוא מדד השנייה של טוהר DNA עם ערכי חומצת "טהור" גרעין בדרך כלל בטווח של 1.8-2.2. יחסי טוהר כי נמוכים משמעותית את ערכי צפוי עשוי להצביע על הטכניקה בידוד בשימוש עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. הספקטרופוטומטרים NanoDrop יכול לשמש גם לכמת חלבונים באמצעות ספיגת ישיר או באמצעות מבחני חלבון colorimetric. כדי להבטיח בטור reproducibility נכונה, 2-μl דגימות מומלץ עבור דגימות חלבון. עיין וידאו יופיטר הבאים: קביעת ריכוז חלבון Microvolume באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610 <p class = "jove_title"> 2. רגישות גבוהה Microvolume quantitation חומצות גרעין שימוש Fluorospectrometer NanoDrop 3300 כדי להפגין רגישות גבוהה quantitation microvolume חומצות גרעין באמצעות NanoDrop 3300, ערכה הקרינה PicoGreen משמש. כדי להתחיל, לאזן את הסטנדרטים ערכת וכל דגימות חומצות גרעין לטמפרטורת החדר. דגימות פלורסנט אור רגיש יש לשמור ענבר או צינורות אלומיניום עטופים. הכן 1x מספיק חיץ TE לכל הסטנדרטים דגימות כדי להימדד כמו גם לפתרון PicoGreen לעבוד כי יהיה צורך. הכן חיץ 1xTE על ידי דילול בתנאי 20x TE חיץ עם מים nuclease חופשי לכל פרוטוקול של היצרן. כרכים תגובת יכול לנוע בין 200 ל μL ul קטנה כמו 10. בדוגמה זו, 10 כרכים התגובה μL יהיה מוכן. הכן סדרתי סטנדרטים בדילול dsDNA בריכוז 2x הרצוי הסופי nuclease ללא צלוחיות או צינורות. העברת 5 μL של כל אחד מן הסטנדרטים dsDNA בדילול אל הפרט שכותרתו nuclease ללא ענבר או קרקרים צינור. 5 Aliquot μL של המדגם כל dsDNA עניין לתוך ענבר nuclease ללא שכותרתו כראוי או קרקרים צינורות. הכן פתרון PicoGreen עובד על פי פרוטוקול של היצרן. העברת נפח שווה של הפתרון PicoGreen עובדים כדי שכל אחת מהן מכילה גם צינור רגיל או מדגם של עניין (5 μL בדוגמה זו). שלב כרכים שווה של 1x TE חיץ פתרון PicoGreen לעבוד כדי להכין את השליטה שלילית, המהווה פתרון התייחסות. מערבבים את תכולת שפופרת כל תגובה ביסודיות על ידי pipetting עדין דגירה התגובות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. כל הסטנדרטים דגימות צריך להיות equilibrated לטמפרטורה זהה לפני המדידה כאות הקרינה מושפעת טמפרטורה. כדי להכין את המכשיר לבצע מדידות, תחילה לנקות את המשטח העליון והתחתון של מערכת השמירה המדגם. 2-3 Pipet μL של מים על פני השטח deionized אופטי נמוך, סגור ולאחר מכן פתח את זרוע המנוף, ומוחה את כנים העליון והתחתון עם נקייה ונטולת מוך, נגב מעבדה. ודא משטחים חופשיים של מוך לפני שתמשיך כמו מוך יכול להציג פלואורסצנציה בנוכחות מקור עירור והוא יכול להפריע המדידה. פתח את התוכנה במכשיר, בחר את "חומצות גרעין" יישומים, ובחר את "PicoGreen-dsDNA" אפשרות. כדי ריק המכשיר, להוסיף 2 μL של 1x TE אל הכן התחתון, לסגור את הזרוע, ולחצו על "ריק" בתחום התוכנה במכשיר. לאחר השלמת ריק, כתם את הפתרון ריק משני משטחים של מערכת השמירה המדגם. מערבבים את הפתרון על ידי התייחסות pipetting עדין. בעזרת טיפים שימור נמוך, μL 2 פיפטה על הדום התחתונה ולסגור את הזרוע. בחר "הפניה" בסוג המדידה, בחר את היחידות הרצויות. לחץ על "מדוד" ליזום את מחזור המדידה. כאשר מחזור המדידה היא מוחלטת, לפתוח את היד וביסודיות למחוק את השמירה מדגם משטחים המערכת. מדוד עד חמש משכפל התייחסות, באמצעות aliquot טרי לשכפל כל אחד. חזור על התהליך עבור הסטנדרטים נוסף לבנות עקומת סטנדרטי. עד שבעה תקנים ניתן להשתמש. התוכנה נועדה לאחסן עד חמישה משכפל עבור כל תקן. משכפל סטנדרטים הם בממוצע כדי ליצור עקומת סטנדרט שממנו ריכוזי מדגם נקבעים באופן אוטומטי. לאחר עקומת הסטנדרטי הוא שלם, בחר את "דוגמאות" הכרטיסייה, הזן את המידע המתאים מזהה מדגם ולמדוד כל מדגם לא ידוע.