A manipulação mecânica de Neurônios para controlar o desenvolvimento Axonal
Summary
Aplicação e medições diretas de forças sobre os neurônios na faixa Microdyne 2000-1000 são obtidos com alta precisão usando agulhas de vidro calibrado. Esta metodologia pode ser usada para controlar e medir vários aspectos do desenvolvimento axonal, incluindo a iniciação axonal, a tensão axonal, a velocidade de alongamento axonal, e vetores de força.
Abstract
Manipulações de células e extensão de axônios neuronal pode ser realizado com vidro calibrado micro-fibras capazes de medir e aplicação de forças na faixa de 1,2 1-10 μdyne. Medidas de força são obtidos através da observação da Hookean flexão das agulhas de vidro, que são calibrados por um método direto e empírica 3. Requisitos de equipamentos e procedimentos para a fabricação, calibração, tratamento e usando as agulhas sobre as células estão completamente descritos. A força de regimes tipos de células usadas anteriormente e diferente para que estas técnicas foram aplicadas demonstrar a flexibilidade da metodologia e são dados como exemplos para futuras investigações 4-6. As vantagens técnicas são as "visualização" contínua das forças produzidas pelas manipulações ea capacidade de intervir diretamente em uma variedade de eventos celulares. Estes incluem a estimulação direta e regulação do crescimento axonal e retração 7, assim como desapego e medições mecânicas em qualquer tipo de células cultivadas 8.
Protocol
Discussion
Técnicas para aplicar e medir forças celulares têm uma longa história 9. Nosso método foi originalmente motivado pelo trabalho de Dennis Bray, que usou agulhas de vidro semelhante ao nosso para "rebocar" os neurônios em uma taxa constante através de um dispositivo motorizado hidráulico 10. Existem muitos meios alternativos de aplicação de forças para as células que incluem: motores de passo 11, 12 esferas magnéticas, vigas microfabricated 13 e fluxos de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos as importantes contribuições do Dr. Robert E. Buxbaum no desenvolvimento desta metodologia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Haynes, L. W. . The Neuron in Tissue Culture. , 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
