Manipulation mécanique des neurones à contrôler le développement axonale
Summary
Mesures d'application directe et des forces sur les neurones dans la gamme 2000-1000 Microdyne sont atteints avec une grande précision en utilisant des aiguilles de verre calibré. Cette méthodologie peut être utilisée pour contrôler et mesurer plusieurs aspects du développement axonal, y compris l'initiation axonale, la tension axonale, la vitesse d'élongation des axones, et les vecteurs de la force.
Abstract
Manipulations de cellules et d'extension des axones neuronaux qui peut être accompli avec le verre calibrées de micro-fibres capables de mesurer et d'appliquer des forces dans la gamme de 1,2 10-1000 μdyne. Les mesures de force sont obtenues par l'observation de la flexion Hooke des aiguilles de verre, qui sont calibrés par une méthode directe et empirique 3. Équipement requis et les procédures de fabrication, d'étalonnage, le traitement et l'utilisation des aiguilles sur les cellules sont entièrement décrits. La force de régimes types cellulaires différents utilisés précédemment et dans laquelle ces techniques ont été appliquées démontrer la flexibilité de la méthodologie et sont donnés comme exemples d'une enquête future 4-6. Les avantages techniques sont l'continu "visualisation" des forces produites par les manipulations et la capacité d'intervenir directement dans une variété d'événements cellulaires. Il s'agit notamment de la stimulation directe et la régulation de la croissance axonale et la rétraction 7, ainsi que le détachement et mesures mécaniques sur tout type de cellule cultivée 8.
Protocol
Discussion
Techniques d'appliquer et de mesurer les forces cellulaires ont une longue histoire 9. Notre méthode a été initialement motivé par le travail de Dennis Bray, qui ont utilisé des aiguilles de verre semblable à la nôtre de «tracter» les neurones à un taux constant en utilisant un dispositif motorisé hydraulique 10. Il ya de nombreux moyens alternatifs d'application de forces pour les cellules qui comprennent: moteurs pas à pas 11, 12 billes magnétiques, les poutres <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à souligner la contribution importante de M. Robert E. Buxbaum dans le développement de cette méthodologie.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
References
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