Nöronlar Aksonal Geliştirme Kontrol Mekanik Manipülasyon
Summary
2000-1000 microdyne aralığında nöronların kuvvet uygulanması ve doğrudan ölçümler kalibre cam iğneler kullanılarak yüksek hassasiyet ile elde edilir. Bu metodoloji aksonal başlatılması, aksonal gerginlik, aksonal uzama hızı, ve kuvvet vektörleri aksonal geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli yönleri, kontrol etmek ve ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Nöron aksonları Hücre ve uzatma manipülasyonlar, mikro-fiberler 10-1000 μdyne aralığı 1,2 güçlerini ölçme ve uygulama yeteneğine sahip kalibre cam ile yapılabilir . Force ölçümler doğrudan ve deneysel yöntem 3 kalibre cam iğneler, bükme Hookean gözlem yoluyla elde edilir. Imalatı, kalibrasyon, tedavi, ve hücreler üzerinde iğneler kullanarak için donatım gereksinimleri ve prosedürleri tam olarak açıklanmıştır. Kuvvet, bu tekniklerin, metodoloji esneklik göstermek uygulanan ve gelecekteki çalışmalar için 4-6 örnek olarak verilmiştir hangi daha önce kullanılan ve farklı hücre tipleri rejimleri. Teknik avantajları manipülasyonlar tarafından üretilen güçlerin sürekli 'görselleştirme ve hücresel olayların çeşitli doğrudan müdahale etme yeteneği vardır. Dekolmanı ve yanı sıra, herhangi bir tür kültür hücre 8 mekanik ölçümler Bu doğrudan uyarılması ve aksonal büyüme ve retraksiyon 7 düzenlenmesi .
Protocol
Discussion
Hücresel güçleri uygulamak ve ölçmek için Teknikleri, uzun bir geçmişi 9 var . Bizim yöntemi başlangıçta motorlu hidrolik cihaz 10 ile sabit bir oranda 'çekici' nöron bizimkine benzer cam iğneler kullanılır Dennis Bray, çalışmalarını motive oldu. Step motorlar 11, manyetik boncuk 12, microfabricated kirişler 13 ve akışkanlar 14: dahil hücreleri kuvvetleri uygulayarak birçok alternatif imkan vardır. Hücresel prob sonuç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu metodolojinin geliştirilmesi Dr. Robert E. Buxbaum önemli katkılar minnetle kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Haynes, L. W. . The Neuron in Tissue Culture. , 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
