Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК на функциональные и структурные анализы

1. Сотовые бесплатно Подготовка Extract. Два грамма сухой бактериальной кишечной палочки получены гранулы с середины логарифмической фазы культуры промывают, дважды, с пол-литра буфера, содержащего 10 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 14 мМ ацетат магния, 60 мМ ацетат калия и 50 мкг / мл phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) путем центрифугирования при 5000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. После мытья бактериальных осадок ресуспендируют в 40 мл буфера А. Бактериальных клеток нарушаются использованием французской прессы, применяя 6000 фунтов на квадратный дюйм давления. Это давление соответствует 600 единиц использовании в один дюйм поршня. Нарушается подвески собирается в чистую стеклянную трубку (50 мл). Нарушается подвески обрабатывают 1 мМ dithiotreitol (DTT) и центрифугируют при 30000 мкг в течение 30 мин. Центрифугирования процедура повторяется, используя полученный супернатант. Окончательный супернатант обойтись (1 мл) в микропробирки. Наконец, аликвоты заморожены использованием сухой лед-этанол или жидкий азот и хранятся при температуре -60 ° С или -80 ° C. 2. Подготовка Сотовые бесплатно Выдержки из обедненного RF2. 4,5 мл белка сефарозе бисером 4B шлам смешивают с 5 мл анти-RF2 анти-сыворотки с помощью вращающегося колеса при комнатной температуре, в течение одного часа. Смесь центрифугируют при 2500 мкг отделить бусы из антисыворотки. После отбрасывания супернатант, эти бусы содержащие анти-RF2 антитела (анти-RF2 бусы) которые потом омывают ресуспендирования в 1 мл буфера В, содержащего 35 мМ Трис-ацетат рН 7,8, 10 мМ ацетат магния, 30 мМ ацетата аммония, 60 мМ калий глутамата и 5 мкг / мл ингибитора протеиназ leupeptin. Анти-RF2 бисер затем отделяется от буфера B центрифугированием с использованием тех же условиях, указанных выше. Мытье процедура повторяется дважды. Один мл бесклеточной экстракт смешивают с 150 мкл анти-RF2 бусин с помощью вращающегося колеса, при 4 ° С, в течение двух часов. Смесь центрифугируют при 10 000 мкг для разделения бесклеточной выписка из бисера. Супернатант удаляют и обрабатывают еще раз с другим 150 мкл анти-RF2 бисером. Эта процедура повторяется еще раз с результатом бесклеточного экстракта решение. Окончательный бесклеточного экстракта решение обойтись (100 мкл) в микропробирки. Аликвоты заморожены использованием сухой лед-этанол или жидкий азот и хранятся при температуре -60 ° С или -80 ° C. 3. Подготовка шаблона ДНК. Подготовка 1 мл ПЦР-реакции путем смешивания 600 femtomoles из плазмиды шаблон, содержащий последовательности должны быть переведены (рис. 1), с 0,4 нмоль каждого из олигодезоксинуклеотиды показано на рис 1, 0,2 мкмоль каждого дНТФ и 50 U из Taq- ДНК-полимеразы в буфер поставляемые Stratagene Ко Выполните усиления реакции при последующих условиях: 94 ° С в течение 2 мин, (94 ° C в течение 30 с, 55 ° C в течение 30 с, 72 ° С в течение 1 мин, в течение 30 циклов) и 72 ° С в течение 12 мин. Purify ПЦР-продуктов путем осаждения ДНК, добавив 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и 2-х томах ледяной этанола. Повторите процедуру осадков еще раз. Ресуспендируют ДНК в 100 мкл диэтил-pyrocarbonate (DEPC) лечение водой. Как правило, эта процедура дает 100 мкг 600 б.п. продукт ДНК. Проверьте целостность продуктов ПЦР методом электрофореза на гелях агарозы. 4. Подготовка Биотин Маркированный мРНК. Подготовка 100 мкл в пробирке транскрипции реакцию в DEPC очищенной воды путем смешивания 5 мкг ПЦР-порожденных фрагмент ДНК с 0,5 мкмоль АТФ, CTP, GTP, 0,3 мкмоль из UTP, 50 нмоль биотина-16-UTP, и 10 мкл Т7 ферментом смеси в буфер поставляемые Promega Ко Инкубируйте реакционной смеси при температуре 37 ° С в течение 3 часов. Чтобы определить количество мРНК получены, ДНК-матрицы должны быть устранены путем добавления РНКазы без ДНКазы. Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 10 мин. Purify мРНК продукции путем осаждения РНК, добавив 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и 2-х томах холодного этанола. Повторите процедуру осадков еще раз. Ресуспендируют мРНК в 100 мкл DEPC лечение водой. Как правило, эта процедура дает около 1-2 мг 600 нт биотин меченых мРНК продукта. Проверьте целостность биотин маркированной продукции мРНК методом электрофореза на агарозном гелях. 5. Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК. Подготовка 500 мкл в пробирке перевод реакционной смеси в DEPC очищенной воды путем смешивания 10-15 мкг биотин-меченых мРНК с 75 нмоль каждого из девятнадцать аминокислот, все, кроме аминокислота, которая будет заменена на радиоактивной аминокислоты , 50 мкКи радиоактивного аминокислота (37MBq) и 20-5 0 мкл RF2 обедненный бесклеточной экстракт, в буфере реакционной смеси, содержащей 40 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 10 мМ ацетат магния, 175 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата аммония, 2 мМ ДТТ, 2 мМ АТФ, 0,5 мМ ГТФ, 30 мМ фосфоенолпирувата (PEP), 0,3 Ед / мл пируваткиназы (PK), 3,5% полиэтиленгликоля 8000, 1 мМ спермидин, 20 мкг / мл фолиевой кислоты и 250 мкг / мл тРНК из Е. палочки. Инкубируйте реакционной смеси при температуре 37 ° С в течение 10 минут. Порядок добавления компонентов реакции является очень важным. Бесклеточной выписка должна быть смешана с первым буфером раствора, содержащего аминокислоты и конечная смесь выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы активация рибосом. Позже, меченных биотином мРНК добавлены. Для структурного анализа с использованием процедуры химической модификации, добавление радиоактивных аминокислот не требуется. Добавить в смесь перевод реакции – 3 мл стрептавидином парамагнитных шариков (SMB), взвешенных в буфере С, содержащего 35 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 10 мМ ацетат магния, 175 мМ ацетата калия, 10 мМ ацетата аммония и 1 мМ DTT. Инкубируйте новая подвеска при комнатной температуре в течение 10 мин. Отдельные малого и среднего бизнеса из смеси с применением магнитного поля (МП) с использованием магнитных стоит разделения. Ресуспендируют малого и среднего бизнеса в буфере С и отдельных бусин еще раз, используя MF. Повторите эту процедуру промывки в два раза. Ресуспендируют бисером в 500 мкл буфера C, хранят подвеску на льду, а также выполнять следующую процедуру немедленно. 6. Анализ Изолированные Рибосомы содержащих пептидил-тРНК. Для пептидил-тРНК Смешать 10 мкл SMB (приостановлено в буфере С) с 10 мкл загрузки буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2,5% (объем / объем) глицерин, 4% додецилсульфата натрия, 2 мМ DTT и 0,2 мг / мл бромфенола синий. Решение компонентов, прикрепленных к бисером, запустив образцов в 10% Трис-tricine гели полиакриламида. Сухой гели с помощью вакуумного геля для сушки волос. Проверьте целостность и очистки пептидил-тРНК, подвергая сухой гель для рентгеновской пленки. Для рибосомальной РНК Добавить 190 мкл 2 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) раствор, приготовленный с DEPC-очищенной воды и 200 мкл фенола уравновешенной с водой, до 10 мкл бусины подвески. Смешайте подвески энергичным вортексе и отдельные неорганические фазы из органической фазы центрифугированием при 10 000 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре. Соберите верхний слой воды в новых микропробирок. Осадок РНК из слоя воды, добавив 1 / 10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,2, 1 мкл 20 мг / мл гликогена решение, и 2-х томах ледяной этанола. Ресуспендируют РНК в 10 мкл DEPC обработанной воды. Проверьте целостность рибосомных РНК с помощью электрофореза на гелях агарозы. Как правило, 50 мкл суспензии бусин дает 1 мкг рибосомных РНК. 7. Представитель Результаты: На рисунке 2 представлены результаты серии анализов оценки качества и функциональности перевода рибосом, выделенных помощью процедуры, описанной. Наблюдение уникальную группу решен в полиакриламидном геле указывает на присутствие полипептидов связаны с биотин-меченых мРНК прилагается к SMB (рис. 2А). Очистка рибосомной РНК с помощью этой процедуры устанавливается наличие рибосом связана с этими меченных биотином мРНК, а также (рис. 2В). Добавление пуромицина, антибиотик, который вызывает пептидил-трансферазы рибосомы, приводит к расщеплению зарождающейся пептидил-тРНК 1. Это наблюдается как сдвиг в структуре миграции изолирован полипептид в полиакриламидном геле (рис. 2С). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что биотин-меченых мРНК прилагается к SMB содержат функциональные рибосом с пептидил-тРНК. Изоляция переводе рибосомы, содержащие конкретные пептидил-тРНК позволяет изучать эффекты пептидил-тРНК, антибиотики и другие молекулы, на рибосомы функции (рис. 3А), а на рибосомы структуру (рис. 3В). В примерах, представленных здесь антибиотик sparsomycin и аминокислота триптофан (Trp) тормозят гидролитического расщепления зарождающейся tnaC-тРНК пептидил-тРНК-индуцированных RF2 в изолированные рибосомы (рис. 3А). Взаимодействие sparsomycin или Trp с рибосомой также вызывает структурные изменения в некоторых нуклеотидов, которые составляют 23S рРНК рибосомы (рис. 3В). Таким образом, биологический материал, полученный с помощью процедуры, описанные здесь, полезны в получении дополнительных понимание структурных контакты участие в подавлении функции рибосомы при его взаимодействии с различными молекулярными факторами. ove_content "> Рисунок 1. Процедура используется для производства и очистки переводе рибосомы содержащие пептидил-тРНК. Фрагменты ДНК ок. 650 б.п. в длину, содержащих ген tnaC и прилегающие к нему области, как показано на рисунке, используются в качестве шаблонов при подготовке мРНК содержащие биотин, [(био) UMP] мРНК. Эти фрагменты ДНК производятся процедуры ПЦР с использованием олигодезоксинуклеотиды указано в верхней части рисунка. Подчеркнутые буквы знак расположения промотора T7 закодирована в нуклеотидной грунт. Жирным шрифтом указывают Обуви-Дальгарно последовательность, которая используется в переводе tnaC последовательностей мРНК. Промоутер T7 в фрагмент ДНК признан Т7 РНК-полимеразы, которая используется для транскрипции (стрелка) tnaC последовательности и некодирующих последовательностей вниз по течению. Транскрипция теряет силу, когда РНК-полимераза достигает 3'-конца фрагмента ДНК, после rpoBC последовательности терминатора (rpoBC «т»). Стволовых петля структуры rpoBC терминатор защищает мРНК с 3'-5 'exoribonuclease активность присутствует в бесклеточных экстрактов, используемых в реакции в пробирке перевода. Изолированные [(био) UMP] мРНК, используются для создания в тупик, переводя рибосомы, используя в анализах пробирке перевода. TnaC последовательность в [(био) UMP] мРНК переводится рибосомой которые киосков, когда последняя аминокислота содержится, в связи с отсутствием выпуска фактор (RF2) из реакционной смеси. Рибосом [(био) UMP] комплексы мРНК изолированы от общей смеси реакции с помощью стрептавидином магнитных шариков (SMB), который связывает биотин-меченых нуклеотидов включены в мРНК. Малого и среднего бизнеса связана с рибосомой-[(био) UMP] мРНК комплексов выделяются из общей реакционной смеси с помощью магнитного поля (МП). Рисунок 2. Структурно-функциональный анализ изолированных комплексов. А) В реакциях пробирке перевод проводились с [(био) UMP] мРНК, в которых стартовый кодон гена tnaC был заменен стоп-кодон. Конечных продуктов были выделены использованием стрептавидина бусы, как это показано на рис 1. Продукты реакции и изолированных молекул затем анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. TnaC-тРНК и tnaC пептид полосы обозначены. Б) Общая РНК была выделена из зашедших в тупик комплексов с использованием фенола процедуры экстракции. Каждый изолированной РНК была решена с помощью электрофореза в агарозном гелях. Рибосомных РНК (рРНК) указаны. С) Изолированные комплексы, содержащие tnaC-тРНК инкубировали с (+) или без (-) 0,02 мМ пуромицин (Puro) при комнатной температуре в течение 10 мин. Пептид tnaC были названы во время трансляции с помощью [35С]-метионина () или [3 H]-пролина (Б). Рисунок 3. Структурно-функциональный анализ рибосом содержащие tnaC-тРНК, которые привязаны к антибиотикам sparsomycin, или аминокислоты триптофана. ) Изолированные комплексы, содержащие tnaC-тРНК инкубировали с (+) или без (-) sparsomycin (Spar) и триптофана (Trp) при комнатной температуре в течение 5 мин. Позже, смеси были смешаны с RF2 и инкубировали при 37 ° С в течение 20 мин. Б) Анализ метилирования изменения в 23S рРНК индуцированных молекул обязательны рибосомы. Изолированные комплексы предварительно инкубировали с (+) или без (-) 2 мМ Trp или Spar в течение 5 мин при 37 ° C. Затем, алкилирования агента, диметилсульфата, был добавлен и смеси инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 мин. Общую РНК экстрагировали и анализы удлинения праймера проводились с [32Р]-меченных oligodeoxynucleotide дополняют нуклеотидов 23S рРНК которые расположены на расстоянии 100 нуклеотидов ниже по течению от модифицированного нуклеотида. Конечными продуктами расширение анализы были решены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. 23S рРНК нуклеотидов, пострадавших от наличия или Trp Spar указаны.