בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

1. תא הכנה חלץ חינם. שני גרם של Escherichia coli יבש חיידקי גלולה המתקבל יומן אמצע תרבויות שלב נשטפים, פעמיים, עם ליטר וחצי של חיץ מ"מ המכיל 10 טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 14 מ"מ, אצטט אשלגן 60 מ"מ, 50 מיקרוגרם / phenylmethanesulphonylfluoride מ"ל (PMSF) על ידי צנטריפוגה ב 5000 X גרם ל 5 דקות ב 4 ° C. לאחר כביסה, גלולה החיידק הוא resuspended ב 40 מ"ל של חיץ א תאים חיידקיים הם שיבשו באמצעות העיתונות הצרפתית, החלת 6000 בלחץ psi. לחץ זה מתאים 600 יחידות באמצעות בוכנה אינץ' אחד. המתלים שיבשו נאסף בתוך שפופרת זכוכית נקי (50 מ"ל). ההשעיה היא שיבשה שטופלו 1 mM dithiotreitol (DTT), והוא centrifuged ב XG 30,000 למשך 30 דקות. ההליך צנטריפוגה חוזרת, באמצעות supernatant שהתקבל. Supernatant הסופי הוא חילק (1 מ"ל) לתוך microtubes. לבסוף, aliquots הם קפואים באמצעות קרח יבש תערובת אתנול או חנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -60 ° C או -80 ° C. 2. הכנת תמציות חינם Cell מדולדלים של RF2. 4.5 מ"ל של חלבון 4B חרוזים sepharose slurry מעורבבים עם 5 מ"ל של אנטי RF2 אנטי סרום באמצעות גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר, במשך שעה אחת. התערובת היא centrifuged ב 2500 XG להפריד את החרוזים מן antiserum. לאחר השלכת supernatant, חרוזים אלה המכילים את אנטי RF2 נוגדנים (אנטי RF2 חרוזים) נשטפים בהמשך מ"ל 1 של חיץ B המכיל 35 מ"מ על ידי resuspension טריס-אצטט pH 7.8, מגנזיום אצטט 10 מ"מ, 30 אמוניום אצטט מ"מ, 60 גלוטמט אשלגן מ"מ ו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של מעכבי proteinase leupeptin. אנטי RF2 חרוזים מופרדות מכן על ידי צנטריפוגה באמצעות אותם התנאים שצוינו לעיל מתוך המאגר B. ההליך כביסה חוזרים פעמיים. אחת מ"ל של תמצית תאים חינם הוא מעורבב עם μL 150 של אנטי RF2 חרוזים באמצעות גלגל מסתובב, ב 4 ° C, למשך שעתיים. התערובת היא centrifuged ב XG 10,000 להפריד את תמצית תאים ללא החרוזים. Supernatant מוסר והתייחס שוב עם μL 150 נוסף של אנטי RF2 חרוזים. הליך זה חזר פעם נוספת עם פתרון התא ללא כתוצאה לחלץ. הפתרון הסופי תא ללא לחלץ הוא חילק (100 μL) לתוך microtubes. Aliquots קפואים באמצעות קרח יבש תערובת אתנול או חנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -60 ° C או -80 ° C. 3. הכנת תבנית ה-DNA. הכן 1 מ"ל PCR-600 תגובה על ידי femtomoles ערבוב של תבנית פלסמיד המכיל את רצפי להיות מתורגם (איור 1), עם 0.4 nanomoles של כל אחד oligodeoxynucleotides המצוין איור 1, 0.2 micromoles של dNTP כל 50-U של תקי פולימראז ה-DNA למאגר מסופק על ידי Stratagene ושות בצע את התגובה הגברה בתנאים בצע: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (94 ° C למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C עבור 1 דקה; עבור 30 מחזורי) ו 72 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. לטהר את מוצרי ה-PCR על ידי מזרז את ה-DNA על ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, ו – 2 כרכים של אתנול קרים כקרח. חזור על הליך משקעים פעם נוספת. Resuspend ה-DNA של 100 μL diethyl-pyrocarbonate (DEPC) טיפול במים. בדרך כלל, הליך זה מניב 100 מיקרוגרם של מוצר bp 600 דנ"א. בדוק את שלמות המוצרים PCR על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose. 4. הכנת ה-mRNA ביוטין תווית. הכן μL 100 בתגובה שעתוק במבחנה במים שטופלו DEPC ידי ערבוב 5 מיקרוגרם של ה-PCR שנוצר שבר את ה-DNA עם 0.5 micromoles של ה-ATP, CTP, GTP, 0.3 micromoles של UTP, 50 nanomoles של ביוטין-16-UTP, ו – 10 μL תערובת של אנזים T7 במאגר מסופק על ידי Promega ושות דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. כדי לכמת את כמות ה-mRNA המתקבל, תבנית ה-DNA צריך לחסל על ידי הוספת RNase ללא DNase. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לטהר את מוצרי ה-mRNA על ידי מזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, ו – 2 כרכים של אתנול קר. חזור על הליך משקעים פעם נוספת. Resuspend ה-mRNA של 100 μL מים שטופלו DEPC. בדרך כלל, זה הליך התשואות בין 1-2 מ"ג של ביוטין 600 nt שכותרתו מוצר ה-mRNA. בדוק את שלמות המוצרים שכותרתו ביוטין mRNA על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose. 5. בידוד של הריבוזומים תרגום המכיל Peptidyl-tRNA. הכן 500 μL של בתערובת תרגום במבחנה התגובה במים שטופלו DEPC ידי ערבוב 10-15 מיקרוגרם של ה-mRNA, ביוטין שכותרתו עם 75 nanomoles של כל אחד חומצות אמינו nineteen, למעט חומצה אמינית אשר יוחלפו על ידי חומצה אמינית רדיואקטיבי , 50 μCi של חומצה אמינית רדיואקטיבי (37MBq), ו 20-5 0 μL של תמצית התא ללא RF2-מדולדל, בתערובת התגובה שנאגרו המכיל 40 מ"מ טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 10 מ"מ, 175 אצטט mM אשלגן, 10 אמוניום אצטט מ"מ, 2 מ"מ DTT, 2 mM ATP, 0.5 mM GTP, phosphoenolpyruvate 30 מ"מ (PEP), 0.3 U / mL קינאז pyruvate (קי), פוליאתילן גליקול 8000 3.5%, 1 spermidine מ"מ, 20 מיקרוגרם / חומצה folinic מ"ל, ו -250 מיקרוגרם / מ"ל tRNA מ E. coli. דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סדר תוספת של מרכיבי התגובה היא מאוד חשובה. תמצית התא ללא חייב להיות מעורב הראשון עם הפתרון למאגר המכיל את חומצות האמינו ואת התערובת הסופית מודגרות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפעלה של הריבוזומים. מאוחר יותר, ביוטין, כינה את mRNAs מתווספים. עבור ניתוחים מבניים באמצעות הליכי שינוי כימי, תוספת של חומצה אמינית רדיואקטיבי אינה נדרשת. מוסיפים לתערובת את התרגום התגובה – 3 מ"ל של חרוזים streptavidin פאראמגנטיים (SMB) תלויה חיץ C המכיל 35 מ"מ טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 10 מ"מ, 175 אצטט mM אשלגן, 10 mM אמוניום אצטט DTT 1 מ"מ. לדגור על השעיית חדש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפרד את SMB מתערובת על ידי הפעלת שדה מגנטי (MF) באמצעות עומד הפרדה מגנטי. Resuspend ה-SMB במאגר C ו-להפריד בין החרוזים שוב באמצעות MF. חזור על נוהל זה שטיפה פעמיים. Resuspend את החרוזים μL 500 של חיץ C, לאחסן את ההשעיה על קרח, לבצע את ההליך הבא מיד. 6. ניתוח של הריבוזומים מבודד מכיל את Peptidyl-tRNA. עבור peptidyl-tRNA מערבבים 10 μL של ה-SMB (תלוי חיץ C) עם 10 μL של חיץ טעינת המכיל 50 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 2.5% (V / V) גליצרול, נתרן גופרתי 4% dodecyl, 2 מ"מ DTT ו – 0.2 מ"ג / mL bromophenol כחול. פתור את הרכיבים המחוברים חרוזים ידי הפעלת דגימות 10% טריס-tricine ג'לים polyacrylamide. יבש את הג'לים באמצעות ואקום ג'ל מייבש. בדוק את שלמות וטיהור של peptidyl-tRNA ידי חשיפת ג'ל יבשים לצלם רנטגן. עבור RNA ריבוזומלי הוספת 190 μL של 2 פתרון ethylenediaminetetraacetate (EDTA) מ"מ מוכן עם מים DEPC שטופלו, ו 200 μL של פנול equilibrated עם מים, כדי μL 10 ההשעיה חרוז. מערבבים את ההשעיה על ידי vortexing נמרץ להפריד את שלב אורגניים משלב אורגני על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. אסוף את שכבת המים העליונה microtube חדש. המשקע RNA משכבת ​​המים על ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, 1 μL של 20 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת גליקוגן, 2 כרכים של אתנול קר כקרח. Resuspend רנ"א μL 10 מים DEPC שטופלו. בדוק את שלמות RNAs ריבוזומלי ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose. בדרך כלל, 50 μL ההשעיה חרוזים התשואות 1μg של רנ"א ריבוזומלי. 7. נציג תוצאות: תרשים 2 מציג את התוצאות של סדרת הניתוחים הערכת איכות התפקוד של הריבוזומים תרגום מבודד באמצעות ההליך המתואר. תצפית של להקה ייחודית נפתרה ג'לים polyacrylamide מעיד על קיומו של פוליפפטידים מאוגדים ביוטין שכותרתו mRNAs מצורף ה-SMB (איור 2 א). טיהור RNAs ריבוזומלי באמצעות הליך זה קובע את נוכחותו של הריבוזומים קשורים אלה ביוטין שכותרתו mRNAs, כמו גם (2B איור). הוספת puromycin, אנטיביוטיקה שגורם לפעילות peptidyl-transferase של הריבוזום, התוצאות המחשוף של המתהווה peptidyl-tRNAs 1. זהו כפי שנצפה שינוי בדפוסי ההגירה של פוליפפטיד בודד ג'לים polyacrylamide (איור 2C). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ביוטין שכותרתו mRNAs מצורף ה-SMB מכילים ריבוזומים פונקציונלי עם peptidyl-tRNAs. הבידוד של הריבוזומים תרגום המכיל ספציפי peptidyl-tRNAs היתרי חקר את ההשפעות של peptidyl-tRNAs, אנטיביוטיקה, ומולקולות אחרות, על תפקיד הריבוזום (איור 3A), וכן על מבנה הריבוזום (איור 3B). בכל הדוגמאות שהוצגו כאן sparsomycin אנטיביוטי לבין חומצת אמינו טריפטופן (TRP) לעכב את המחשוף hydrolytic של המתהווה tnaC-tRNA peptidyl-tRNA המושרה על ידי RF2 את הריבוזומים מבודד (איור 3A). האינטראקציה של sparsomycin או TRP עם הריבוזום גורם גם שינויים מבניים כמה נוקלאוטידים, המהווים את rRNA 23S של הריבוזום מתרגם (איור 3B). לסיכום, חומר ביולוגי שהושגו באמצעות ההליך המתואר כאן מועילים בהשגת הבנה נוספת של הקשרים המבניים המעורבים עיכוב של פונקציה הריבוזום על האינטראקציה שלו עם גורמים מולקולריים שונים. ove_content "> באיור 1. נוהל המשמש לייצור ולטהר הריבוזומים תרגום המכיל peptidyl-tRNAs. שברי DNA CA. 650 נ"ב אורך, המכיל את הגן tnaC ואת האזור הסמוך שלו, שמוצג באיור, משמשים כתבניות בהכנת mRNAs המכיל ביוטין, [(ביו) UMP] mRNA. שברים אלה DNA המיוצרים על ידי נהלים PCR באמצעות oligodeoxynucleotides המצוין בחלק העליון של הדמות. אותיות המסומנות בקו תחתון לסמן את המיקום של האמרגן T7 מקודד פריימר נוקלאוטיד. באותיות לציין את רצף Shine-Dalgarno המשמש התרגום של רצפי ה-mRNA tnaC. האמרגן T7 בקטע ה-DNA הוא מוכר על ידי RNA פולימראז T7 המשמש לתמלל (חץ) את רצף tnaC ואת ללא קידוד במורד רצף. תמלול הוא הופסק כאשר RNA פולימראז מגיע לסוף 3'של קטע ה-DNA, לאחר רצף שליחות קטלנית rpoBC (rpoBC "t"). המבנה גזע לולאה של שליחות קטלנית rpoBC מגן על ה-mRNA מההווה פעילות 3'-5 "exoribonuclease את התא ללא תמציות בשימוש בתגובות במבחנה תרגום. מבודדים [(ביו) UMP] mRNAs משמשים ליצירת נתקע, ריבוזומים תרגום, תוך שימוש ב מבחני חוץ גופית תרגום. רצף tnaC ב [(ביו) UMP] mRNA מתורגם ע"י הריבוזום אשר דוכני כאשר החומצה האמינית האחרונה משולב, בשל העדר גורם שחרור (RF2) מתערובת התגובה. הריבוזום-[(ביו) UMP] מתחמי mRNA מבודדים מתערובת התגובה הכולל שימוש streptavidin מגנטי, חרוזים (SMB) המחייבות את ביוטין שכותרתו נוקלאוטידים שולבו-mRNA. עסקים קטנים ובינוניים חייב את הריבוזום-[(ביו) UMP] מתחמי mRNA המחולצים מתערובת התגובה הכולל באמצעות שדה מגנטי (MF). איור 2. מנתחת מבניים ותפקודיים של מתחמי מבודדים. א) תגובות במבחנה תרגום בוצעו עם [(ביו) UMP] mRNAs שבו קודון ההתחלה של הגן tnaC הוחלף קודון עצירה. המוצרים הסופיים היו מבודדים באמצעות חרוזים streptavidin, כפי שעולה באיור 1. תוצרי התגובה ומולקולות מבודד נותחו לאחר מכן על ידי אלקטרופורזה על ג'ל polyacrylamide. TnaC-tRNA ו tnaC להקות פפטיד מסומנים. ב) סך RNA היה מבודד מן מתחמי נתקע באמצעות מיצוי הליכים פנול. כל RNA בודד נפתרה על ידי אלקטרופורזה ב agarose ג'לים. RNAs ריבוזומלי (rRNAs) מצוינים. ג) מתחמי מבודד המכיל tnaC-tRNAs הודגרו עם (+) או בלי (-) 0.02 mM puromycin (פורו) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפפטיד tnaC תויגו במהלך התרגום באמצעות [35S]-מתיונין (א) או [3H]-פרולין (B). איור 3. מנתחת מבניים ותפקודיים של הריבוזומים המכיל tnaC-tRNA המאוגדים sparsomycin אנטיביוטי, או חומצת אמינו טריפטופן. א) מתחמי מבודד המכיל tnaC-tRNAs הודגרו עם (+) או בלי (-) sparsomycin (Spar) או טריפטופן (TRP) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מאוחר יותר, תערובות היו מעורבבים עם RF2 וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ב) ניתוח השינויים מתילציה ב 23S rRNA הנגרם על ידי מולקולות מחייב בתוך הריבוזום. מתחמי מבודד היו מראש מודגרות עם (+) או בלי (-) 2 מ"מ או TRP Spar במשך 5 דקות ב 37 ° C. ואז, סוכן אלקילציה, דימתיל סולפט, נוספה ותערובות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות נוספות. סך RNA הופק והסיומת מבחני פריימר בוצעו עם [32P] שכותרתו oligodeoxynucleotide משלים את הנוקליאוטידים של rRNA 23S אשר מחולקת 100 נוקלאוטידים downstream של נוקלאוטיד שונה. המוצרים הסופיים של מבחני הרחבה נפתרו על ידי אלקטרופורזה על ג'ל polyacrylamide. נוקלאוטידים 23S rRNA מושפעים על ידי נוכחות של TRP או Spar מצוינים.