Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA's voor functionele en structurele analyses

1. Cel Gratis Extract voorbereiding. Twee gram van een droge Escherichia coli bacteriën pellet verkregen uit mid-log-fase culturen worden gewassen, tweemaal, met een halve liter buffer A die 10 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 14 mM magnesiumacetaat, 60 mM kaliumacetaat en 50 ug / mL phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na het wassen, is de bacteriële pellet geresuspendeerd in 40 ml buffer A. De bacteriële cellen verstoord met behulp van een Franse pers, het toepassen van 6000 psi druk. Deze druk komt overeen met 600 eenheden met behulp van een een-inch zuiger. De verstoorde suspensie wordt verzameld in een schone glazen buis (50 ml). De verstoorde suspensie wordt behandeld met 1 mM dithiotreitol (DTT) en gecentrifugeerd bij 30.000 xg gedurende 30 minuten. Het centrifugeren procedure wordt herhaald, met behulp van de resulterende supernatant. De laatste supernatant is afgegeven (1 ml) in microbuisjes. Ten slotte worden de monsters bevroren met behulp van een droog ijs-ethanol mengsel of vloeibare stikstof, en worden opgeslagen bij -60 ° C of -80 ° C. 2. Voorbereiding van de Cel Vrije Extracten van verarmd RF2. 4,5 ml proteïne A Sepharose 4B slurry kralen worden gemengd met 5 ml van een anti-RF2 anti-serum met behulp van een draaiend wiel op kamertemperatuur, gedurende een uur. Het mengsel wordt gecentrifugeerd bij 2500 xg om de kralen te scheiden van het antiserum. Bij het weggooien van de supernatant, zijn deze kralen die de anti-RF2 antilichamen (anti-RF2 kralen) later gewassen door resuspensie in 1 ml buffer B met 35 mM Tris-acetaat pH 7,8, 10 mM magnesiumacetaat, 30 mM ammoniumacetaat, 60 mM kalium glutamaat en 5 ug / ml leupeptin proteinase inhibitor. De anti-RF2 parels worden vervolgens gescheiden van buffer B door centrifugeren met dezelfde hierboven vermelde voorwaarden. Het wassen procedure wordt tweemaal herhaald. Een ml van de cel-extract wordt gemengd met 150 pi van de anti-RF2 kralen met behulp van een draaiend wiel, bij 4 ° C, gedurende twee uur. Het mengsel wordt gecentrifugeerd bij 10.000 xg voor de celvrije extract te scheiden van de kralen. Het supernatant wordt verwijderd en behandeld opnieuw met een andere 150 ul van anti-RF2 kralen. Deze procedure wordt nog eens herhaald met de daaruit voortvloeiende celvrije extract oplossing. De uiteindelijke celvrije extract oplossing is afgegeven (100 pi) in microbuisjes. De monsters worden bevroren met behulp van een droog ijs-ethanol mengsel of vloeibare stikstof, en worden opgeslagen bij -60 ° C of -80 ° C. 3. De voorbereiding van een DNA-template. Bereid een 1 ml PCR-reactie door het mengen van 600 femtomoles van het plasmide sjabloon met de sequenties te vertalen (afb. 1), met 0,4 nanomoles van elk van de oligodeoxynucleotides aangegeven in figuur 1, 0,2 micromol per dNTP en 50 U van Taq- DNA-polymerase in de buffer geleverd door Stratagene Co Voer de amplificatiereactie onder de te volgen voorwaarden: 94 ° C gedurende 2 min, (94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 minuut, voor 30 cycli) en 72 ° C gedurende 12 minuten. Zuiveren de PCR-producten door neerslaan van het DNA door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, en 2 volumes ijskoude ethanol. Herhaal de neerslag procedure nog een keer. Resuspendeer de DNA in 100 ul van diethyl-pyrocarbonate (DEPC) behandelde-water. Typisch, deze procedure levert 100 ug van een 600 bp DNA product. Controleer de integriteit van de PCR-producten door middel van elektroforese op agarose gels. 4. De voorbereiding van biotine Labeled mRNA. Bereid een 100 ul in vitro transcriptie reactie in DEPC behandelde water door het mengen van 5 ug van het PCR-gegenereerde DNA-fragment met 0,5 micromol ATP, CTP, GTP, 0,3 micromol UTP, 50 nanomoles van biotine-16-UTP, en 10 uL van T7 enzym mix in de buffer geleverd door Promega Co Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 3 uur. Het kwantificeren van de hoeveelheid van de verkregen mRNA, moet de DNA-template worden geëlimineerd door het toevoegen van RNase-vrij DNase. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Zuiveren het mRNA producten door neerslaan van de RNA door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, en 2 volumes koude ethanol. Herhaal de neerslag procedure nog een keer. Resuspendeer de mRNA in 100 ul DEPC behandelde water. Meestal is deze procedure levert tussen 1-2 mg van een 600 nt biotine gelabelde mRNA product. Controleer de integriteit van de biotine gelabelde mRNA producten door elektroforese op agarose gels. 5. Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende een peptidyl-tRNA. Bereid 500 pi van een in vitro vertaling reactiemengsel in DEPC behandelde water door het mengen van 10 tot 15 ug van biotine-gelabelde mRNA met 75 nanomoles van elk van de negentien aminozuren, alle met uitzondering van het aminozuur dat zal worden vervangen door een radioactief aminozuur , 50 uCi een radioactieve aminozuur (37MBq) en 20-5 0 ul van RF2-lege cel-extract, in een gebufferde reactiemengsel dat 40 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 10 mM magnesiumacetaat, 175 mM kaliumacetaat, 10 mM ammoniumacetaat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM fosfoenolpyruvaat (PEP), 0,3 U / ml pyruvaat kinase (PK), 3,5% polyethyleenglycol 8000, 1 mM spermidine, 20 ug / ml folinezuur, en 250 ug / ml tRNA van E. coli. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 10 minuten. De volgorde van toevoeging van de reactie componenten is erg belangrijk. De cel-extract moet eerst worden gemengd met de buffer oplossing die de aminozuren en de uiteindelijke mengsel geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de activering van de ribosomen mogelijk te maken. Later worden de biotine-gelabelde mRNA's toegevoegd. Voor structurele analyses met behulp van chemische modificatie procedures, is de toevoeging van een radioactief aminozuur niet vereist. Toe te voegen aan de vertaling reactiemengsel – 3 ml streptavidine paramagnetische kralen (SMB) gesuspendeerd in buffer C met 35 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 10 mM magnesiumacetaat, 175 mM kaliumacetaat, 10 mM ammoniumacetaat en 1 mM DTT. Incubeer de nieuwe ophanging bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Scheid de SMB uit het mengsel door het aanbrengen van een magnetisch veld (MF) met behulp van magnetische scheiding staat. Resuspendeer de SMB in buffer C en weer scheiden de kralen met behulp van de MF. Twee keer Herhaal deze procedure wassen. Resuspendeer de kralen in 500 ul buffer C, bewaar de suspensie op ijs, en meteen voer de volgende procedure. 6. Analyse van de geïsoleerde Ribosomen Bevat de peptidyl-tRNA. Voor peptidyl-tRNA Mix 10 pi van de SMB (gesuspendeerd in buffer C) met 10 pi van een laad-buffer die 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) glycerol, 4% natriumdodecylsulfaat, 2 mM DTT en 0,2 mg / mL broomfenolblauw. Het oplossen van de componenten aan de kralen door het uitvoeren van de monsters in 10% Tris-tricine polyacrylamide gels. Droog de gels met behulp van een vacuüm gel-droger. Controleer de integriteit en de zuivering van het peptidyl-tRNA door het blootstellen van de gedroogde gel om een ​​X-ray film. Voor ribosomaal RNA Voeg 190 ul van 2 mM ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) oplossing bereid met DEPC behandeld water en 200 pi van fenol evenwicht gebracht met water, tot 10 ul van een kraal schorsing. Meng de opschorting door krachtige vortexen en scheiden de anorganische fase van de organische fase door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenste waterlaag in een nieuwe microbuisjes. Neerslag het RNA uit de waterlaag door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, 1 pi van 20 mg / ml van glycogeen oplossing en twee volumes van ijskoude ethanol. Resuspendeer de RNA in 10 ul van DEPC-behandeld water. Controleer de integriteit van de ribosomale RNA's door elektroforese op agarose gels. Meestal, 50 ul van kralen opschorting opbrengst 1μg van ribosomaal RNA. 7. Representatieve resultaten: Figuur 2 presenteert de resultaten van een reeks analyses evaluatie van de kwaliteit en functionaliteit van het vertalen van ribosomen geïsoleerd met behulp van de procedure geschetst. De waarneming van een unieke band opgelost in polyacrylamide gels duidt op de aanwezigheid van polypeptiden gebonden aan de biotine-gelabelde mRNA's verbonden aan het SMB (Figuur 2A). De zuivering van ribosomaal RNA's gebruik van deze procedure stelt de aanwezigheid van ribosomen gebonden aan deze biotine-gelabelde mRNA's, maar ook (Figuur 2B). Toevoeging van puromycine, een antibioticum dat de peptidyl-transferase activiteit van het ribosoom induceert, resulteert in een splitsing van de opkomende peptidyl-tRNA's 1. Dit wordt waargenomen als een verschuiving in het migratiepatroon van het geïsoleerde polypeptide in polyacrylamide gels (figuur 2C). Samen vormen deze gegevens blijkt dat biotine-gelabelde mRNA's verbonden aan het SMB functionele ribosomen bevatten met peptidyl-tRNA's. De isolatie van het vertalen van ribosomen met specifieke peptidyl-tRNA's maakt de studie van de effecten van peptidyl-tRNA's, antibiotica, en andere moleculen, op ribosoom functie (figuur 3A) en op ribosoom structuur (Figuur 3B). In de voorbeelden die hier het antibioticum sparsomycin en het aminozuur tryptofaan (Trp) remmen de hydrolytische splitsing van de ontluikende tnaC-tRNA peptidyl-tRNA veroorzaakt door RF2 in de geïsoleerde ribosomen (Figuur 3A). De interactie van sparsomycin of Trp met het ribosoom induceert ook structurele veranderingen in een aantal nucleotiden dat de 23S rRNA van het vertalen van ribosoom (afb. 3B) vormen. Kortom, de biologisch materiaal verkregen met behulp van de hier beschreven procedure zijn nuttig bij het verkrijgen van extra inzicht in de structurele contacten die betrokken zijn bij de remming van ribosoom-functie op de interactie met verschillende moleculaire factoren. ove_content "> Figuur 1. Procedure die wordt gebruikt voor het produceren en zuiveren het vertalen van ribosomen met peptidyl-tRNA's. DNA-fragmenten ca. 650 bp in lengte, met de tnaC gen en de aangrenzende regio, in de figuur, worden gebruikt als sjablonen bij het ​​opstellen van mRNA's met biotine, [(bio) UMP] mRNA. Deze DNA-fragmenten worden geproduceerd door PCR-procedures met de oligodeoxynucleotides aangegeven op de bovenkant van de figuur. Onderstreepte letters markeren de locatie van de T7 promoter gecodeerd in het nucleotide primer. Vetgedrukte letters geven de Shine-Dalgarno sequentie die wordt gebruikt in de vertaling van de tnaC mRNA sequenties. De T7 promoter in het DNA-fragment wordt herkend door T7 RNA-polymerase dat gebruikt wordt om transcriberen (pijl) de tnaC volgorde en het niet-coderende sequentie stroomafwaarts. Transcriptie wordt beëindigd bij het ​​RNA-polymerase bereikt het 3'-uiteinde van het DNA-fragment, na de rpoBC terminator-sequenties (rpoBC "t"). De stam-lus structuur van de rpoBC terminator beschermt de mRNA van de 3'-5 'exoribonuclease activiteit aanwezig in de cel-vrije extracten gebruikt in de in vitro translatie reacties. De geïsoleerde [(bio) UMP] mRNA's worden gebruikt om de vastgelopen, het vertalen van ribosomen genereren, met behulp van in vitro translatie assays. De tnaC volgorde in de [(bio) UMP] mRNA wordt vertaald door een ribosoom, die stopt wanneer de laatste aminozuur is opgenomen, te wijten aan de afwezigheid van de Release Factor (RF2) uit het reactiemengsel. Het ribosoom-[(bio) UMP] mRNA-complexen geïsoleerd zijn van de totale reactiemengsel met behulp van streptavidine-magnetische-korrels (SMB), die de biotine-gelabelde nucleotiden opgenomen in het mRNA te binden. De kleine en middelgrote bedrijven gebonden aan de ribosoom-[(bio) UMP] mRNA-complexen worden uit de totale reactiemengsel met behulp van een magnetisch veld (MF). Figuur 2. Structurele en functionele analyse van de geïsoleerde complexen. A) In vitro vertaling reacties werden uitgevoerd met [(bio) UMP] mRNA's waarin het startcodon van het tnaC-gen werd vervangen door een stopcodon. De eindproducten werden geïsoleerd met behulp van streptavidine parels, zoals is aangegeven in figuur 1. Reactieproducten en geïsoleerde moleculen werden vervolgens geanalyseerd door elektroforese op polyacrylamide gels. De tnaC-tRNA en tnaC peptide banden zijn gemarkeerd. B) Totaal RNA werd geïsoleerd uit de vastgelopen complexen met behulp van fenolextractie procedures. Elke geïsoleerde RNA werd opgelost door elektroforese in agarose gels. Ribosomaal RNA (rRNA) worden aangegeven. C) Geïsoleerd complexen die tnaC-tRNA's werden geïncubeerd met (+) of zonder (-) 0,02 mM puromycine (Puro) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. De tnaC peptide werden gemerkt tijdens de vertaling met behulp van [35S]-methionine (A) of [3H]-proline (B). Figuur 3. Structurele en functionele analyse van ribosomen met tnaC-tRNA die zijn gebonden aan de antibiotica sparsomycin, of het aminozuur tryptofaan. A) Geïsoleerde complexen die tnaC-tRNA's werden geïncubeerd met (+) of zonder (-) sparsomycin (Spar) of tryptofaan (Trp) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Later werden de mengsels gemengd met RF2 en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. B) analyse van methylatie veranderingen in de 23S rRNA veroorzaakt door moleculen binden binnen het ribosoom. Geïsoleerde complexen werden vooraf geïncubeerd met (+) of zonder (-) 2 mM Trp of Spar gedurende 5 min bij 37 ° C. Vervolgens werd een alkylerings agent, dimethyl sulfaat, toegevoegd en het mengsel geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende een extra 20 minuten. Totaal RNA werd geëxtraheerd en primer extensie testen werden uitgevoerd met een [32P]-gelabeld oligodeoxynucleotide complementair zijn aan de nucleotiden van 23S rRNA, die zijn verdeeld stroomafwaarts 100 nucleotiden van de gewijzigde nucleotide. De eindproducten van de uitbreiding assays werden opgelost door elektroforese in polyacrylamide gels. De 23S rRNA nucleotiden beïnvloed door de aanwezigheid van de Trp-of Spar worden aangegeven.