عزلة ريبوسوم ترجمة المتضمن ببتيديل - tRNAs للتحليلات الوظيفية والهيكلية
Summary
وعائقا رئيسيا أمام التحليلات الكيميائية الحيوية للريبوسوم تحتوي الوليدة ببتيديل – tRNAs تم بحضور ريبوسوم أخرى في نفس العينات ، ريبوسوم لم يشارك في الترجمة من تسلسل مرنا محددة يجري تحليلها. وضعنا منهجية بسيطة لتنقية ، حصرا ، على ريبوسوم تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال – ببتيديل الوليدة من الفائدة.
Abstract
مؤخرا ، لم مفصلة الدراسات البنيوية والبيوكيميائية العديد من الأحداث الجزيئية التي تحدث في الريبوسوم خلال تثبيط تخليق البروتين بواسطة المضادات الحيوية ، وخلال التوليف ببتيد الوليدة. بعض هذه المضادات الحيوية ، والبروتينية الوليدة التنظيمية معظمها في شكل ببتيديل – tRNAs ، إما تمنع تشكيل ببتيد السندات أو إنهاء الترجمة 1-7. ووصف ظاهرة المثبطة هذه الأحداث يمكن أن يوقف حركة الريبوسوم "اعتقال متعدية". وقد تبين اعتقال الترجمة الناجمة عن المضادات الحيوية an إما أو ببتيد الوليدة لتنظيم التعبير عن جينات لها دور في الوظائف الخلوية متنوعة مثل نمو الخلايا ، ومقاومة المضادات الحيوية ، إزفاء البروتين واستقلاب الخلية 8-13. معرفة كيفية المضادات الحيوية والبروتينية الوليدة يغير وظيفة تنظيمية الريبوسوم أمر ضروري إذا أردنا أن نفهم الدور الكامل للالريبوسوم في الترجمة ، في كل حي.
هنا ، نحن تصف منهجية بسيطة التي يمكن استخدامها لتنقية ، حصرا ، للتحليل ، تلك ريبوسوم ترجمة ومرنا محددة ومعينة تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال ببتيديل – 14. ويستند هذا الإجراء على العزلة الانتقائي للريبوسوم ترجمة منضم إلى مرنا البيوتين المسمى. وتفصل هذه المجمعات متعدية من ريبوسوم أخرى في الخليط نفسه ، وذلك باستخدام الخرز ممغطس streptavidin (SMB) ، والمجال المغناطيسي (وسط). وقد تم تجميع mRNAs البيوتين المسمى النسخ بواسطة فحوصات الاعادة باستخدام القوالب وشظايا الحمض النووي لتوليد PCR التي تحتوي على المروجين T7 النسخي. T7 بوليميريز RNA تتضمن البيوتين – 16 – UMP من البيوتين UTP ، في ظل ظروفنا وتدمج ما يقرب من عشرة البيوتين – 16 – UMP الجزيئات في الإقليم الشمالي 600 مرنا مع الحزب الحاكم على نسبة 25 ٪. ثم يتم عزل هذه البيوتين المسمى mRNAs ، واستخدامها في المختبر في إجراء فحوصات الترجمة مع عامل الإصدار 2 (RF2) – المنضب خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها مقتطفات من سلالات كولاي التي تحتوي على نوع البرية أو ريبوسوم متحولة. وتعثرت ريبوسوم ترجمة البيوتين المسمى متواليات مرنا في المنطقة رامزة توقف ، ونظرا لغياب بروتين RF2 ، الذي يحقق في العادة إنهاء الترجمة. معزولون ريبوسوم المتعثرة التي تحتوي على توليف حديثا ببتيديل – الحمض الريبي النووي النقال وإزالتها من ردود الفعل والترجمة باستخدام SMB MF ملف. هذه الخرز فقط ربط البيوتين المحتوية على الرسائل.
يمكن استخدام معزولة والمجمعات متعدية ، وتحليل الخصائص الهيكلية والوظيفية من النوع البري أو مكونات الريباسي متحولة ، أو تسلسل الحمض الريبي النووي النقال ببتيديل ، وكذلك تحديد الريبوسوم التفاعل مع المضادات الحيوية أو غيرها من العوامل الجزيئية 1،14-16. لفحص وظيفة هذه المجمعات الريبوسوم معزولة ، يمكن إجراء فحوصات ببتيديل – ترانسفيراز في وجود المضادات الحيوية بوروميسين 1. لدراسة التغيرات الهيكلية في المجمعات متعدية ، يمكن استخدام إجراءات راسخة ، مثل ط) يشابك إلى الأحماض الأمينية المحددة 14 و / أو الثاني) المقايسات حماية ألكلة 1،14،17.
Protocol
Discussion
ووصف هذا الإجراء عزلة في هذا التقرير هو تكرار للغاية. للأسف ، لا يمكن وجود قصيرة ببتيديل – tRNAs المنتجة من نفس تسلسل ترجم يمكن تجنبها بسهولة ، مثل ببتيديل – tRNAs قد تتوافق مع 15-20 ٪ من مجموع المواد المعزولة (الشكل 2C). قد تكون هذه الزيادة في تركيز الملوثات عندما استخدمت تركيزات أعلى من مرنا البيوتين المسمى أو عند استخراج خالية من الخلايا المستخدمة قديمة أو أعيد استخدامها عدة مرات. لذا ، فمن المهم جدا للتحكم في جودة وتركيز عناصر في التفاعلات الترجمة المختبر. بدلا من ذلك ، أعادت عالية الكفاءة التجارية خالية من الخلايا مقتطفات المتاحة التي يمكن استخدامها للأغراض نفسها (نظام PURE) 18.
باستخدام هذا الأسلوب ، يتم تضمينها بشكل عشوائي البيوتين – 16 – UMP على طول ومرنا الهدف. هناك احتمال أن بعض ORFs تحتوي على مساحات يوريدين قد أدرجت هذا المعدل في متواليات النوكليوتيدات بهم ، مما يؤثر على ترجمتها. تركيزات النسبية متغير biotin-16-UTP/UTP أن يتم اختبارها خلال تجميعي للمرنا من أجل الحصول على ترجمة أكثر كفاءة. ويمكن استخدام أساليب بديلة لوضع العلامات البيوتين ، واستهداف 5' نهاية ، ونهاية الأكثر استقرارا من mRNAs. يمكن (ط) أن يرفق البيوتين إلى نهاية 5' – مرنا للاستخدام 3' – NH2ATP (3' الأمينية ، 3' – deoxyadenosine ثلاثي الفوسفات) و T4 RNA يغاز 19. يمكن (ب) أن يرفق 5' نهاية البيوتين المسمى قليل النوكليوتيد إلى نهاية 5' – مرنا للاستخدام الحمض النووي الريبي T4 يغاز كذلك 20. يمكن (الثالث) كما في نهاية 3' البيوتين المسمى oligodeoxynucleotides التي تتوافق مع تسلسل تكميلية في نهاية 5' – مرنا من أن تستخدم لعزل المجمعات ترجمة. يمكن أن تعلق هذه oligodeoxynucleotides البيوتين المسمى إلى الشركات الصغيرة والمتوسطة قبل العزلة. في وقت لاحق SMB تعلق على البيوتين المسمى oligodeoxynucleotides يمكن أن تكون مختلطة مع الترجمة خليط التفاعل للسماح لهم التفاعل مع تسلسل مرنا التكميلية. بعد العزلة ، والهجين RNA – DNA المنطقة — والمنطقة التهجين بين oligodeoxynucleotide البيوتين المسمى وتسلسل مرنا — يمكن استخدام المتدهورة ريبونوكلياز H ، التي تفصل بين المجمعات المتعثرة من الخرز streptavidin. هذا الأسلوب قد بديلة تسمح لاستخدامها في المجمعات في التحليلات الهيكلية في المستقبل باستخدام أساليب دقة أعلى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LRC – V. يرغب في تكريس هذه الورقة لذكرى الدكتور جونسون Adriel دال ، وهو أستاذ الرائع الذي الاولوية رقم واحد كان دائما في تعليم الطلاب. نحن نفتقدك ، Adriel. نحن ممتنون لمورينو جاكلين لمساعدتها في أداء والتجارب المذكورة في هذه الدراسة. وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة تقدم إلى CY من مؤسسة العلوم الوطنية ، MCB – 0615390 ، وعبر صناديق المبتدئة التي قدمت إلى الصليب الأحمر اللبناني – V من جامعة الاباما في هانتسفيل.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris base | Sigma | 252859 | ||
| Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
| Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
| Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
| Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
| Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
| T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
| SMB | Promega | Z5482 | ||
| Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
| ATP | Sigma | A7699 | ||
| GTP | Sigma | G8877 | ||
| PEP | Sigma | P7002 | ||
| PK | Sigma | P7768 | ||
| Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
| Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
| Spermidine | Fluka | 85558 | ||
| tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| Tricine | Sigma | T5816 | ||
| L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
| DTT | Fluka | 43815 | ||
| magnetic separation stands | Promega | Z5342 |
References
- Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).
- Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA. J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).
- Gaynor, M., Mankin, A. S. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance. Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).
- Polacek, N., Mankin, A. S. The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).
- Steitz, T. A. Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target. Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).
- Tenson, T., Mankin, A. Antibiotics and the ribosome. Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).
- Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome. Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).
- Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript. J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).
- Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).
- Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA. Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Onouchi, H. Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis. Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).
- Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA. J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).
- Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression. Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).
- Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression. J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).
- Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression. J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).
- Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center. J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).
- Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
- Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. isotope- or biotin-labeling of the 5 ‘-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase. Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).
- Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase. Mol Divers. 4, 187-190 (1998).
