in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。
アルファウイルス形質導入システム(ATS)は、感染時に関心のある遺伝子(GOI)を発現するための重要なツールです。 ATSSは蚊媒介性RNAウイルスのcDNAクローン(;トガウイルス科属のアルファウイルス )から導出されます。 アルファウイルス属には約30の異なる蚊が媒介するウイルス種が含まれています。アルファウイルスは、エンベロープウイルスであり、一本鎖RNAゲノムを(〜11.7 KB)が含まれています。アルファウイルスは、ウイルスのゲノムと成熟のキャプシド形成に必要なウイルスの構造タンパク質をコードサブゲノムmRNAを転写。アルファウイルスは脊椎動物細胞では通常非常に溶解性であるが、持続的に最小限の細胞病理学に影響を受けやすい蚊の細胞に感染。これらの属性は、それらの蚊の遺伝子発現のための優れたツールとして利用できます。使用中の最も一般的なATSSは、シンドビスウイルス(SINV)から導出されます。 SINVの広範な種指向性は、昆虫鳥類、および哺乳類cells8の感染が可能になります。しかし、ATSSはよく9,10,20のような他のアルファウイルスに由来している。外来遺伝子の発現は、追加のウイルスのサブゲノムRNAの開始部位やプロモーターの挿入によって実現されています。外来遺伝子の配列はウイルス構造遺伝子の5'側に配置されているATSSは昆虫で安定したタンパク質発現のために使用されます。遺伝子配列が構造遺伝子の3'側に配置されているATSSは、RNAiと沈黙昆虫におけるその遺伝子の発現をトリガするために使用されます。
ATSSはベクトル-病原体相互作用、ウイルス複製の分子の詳細とメンテナンス感染サイクル3,4,11,19,21を理解するための貴重なツールであることが証明されている。特に、蛍光と生物発光レポーターの発現は、ベクターとウイルス伝送5,14-16,18でウイルス感染を追跡尽力している。さらに、ベクトル免疫応答は、GFP 2,9を表現するために設計さSINVの二系統を用いて記述されています。
ここで、我々はcDNAの感染性クローンから蛍光レポーター(GFP)を含むSINVの製造方法を示す。伝染性、完全長のRNAは、線形化されたcDNAクローンから転写される。感染性RNAをエレクトロポレーションによって許容標的細胞に導入する。トランスフェクションされた細胞は、GOIを発現している感染性ウイルス粒子を生成する。収穫されたウイルスは、ここで説明する蚊、、または他のホストの種を(ここでは図示せず)に感染するために使用されます。ベクトルの能力は、中腸外蛍光を検出することにより、または監視のウイルスの伝達7によって評価される。 GOIは、感染率の決定のために、細胞培養全体に広がるウイルスの便利な推定、露出蚊の普及、蚊からのウイルスの伝達を可能にするとベクトルの能力の急速なゲージを提供するので、蛍光レポーターを使用してください。
メソッドは、研究者は蚊細胞培養と大人のメス蚊のアルファウイルスの感染に従うことを可能にするここで紹介。 ATSのウイルスを使用しての長所と短所を表2にまとめた。 ATS感染性クローンは、遺伝的にどんなGOIを表現するために操作することができますし、一本鎖抗体、RNAiの抑制、内因性遺伝子を標的とするアンチセンスRNA、およびアポトーシスタンパク質を発現するために使用されています。レポーターが使用されていない場合、このメソッドの撮像部は関係ありません。しかし、同じプロトコルの多くは、ATSのウイルスの救助、伝播、および蚊の感染に必要です。アルファウイルス形質導入システムに挿入する際の制限が導入遺伝子の最大サイズがあります。サイズの制約は、ATSを生成するために使用される親株によって異なりますが、そのようなホタルルシフェラーゼのような大規模なレポーター遺伝子は、蚊で使用するためにATSを構築するために使用されているものの、約1KB通常です。ウイルス学の背景の適度な量の研究室では、ATSのこれらのプロトコルに従って使用することができるはずです。研究室の数はすでにSINVベースのATSのを使用してのことです。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、国立衛生研究所(NIH R01 AI46435)とRMRCE(NIH AI065357)によってサポートされています。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | ||
MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. | |
Cap Analogue (m7G(5′)ppp(5′)G) | Ambion | AM8050 | ||
Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | ||
Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |