ووصف الطرق لاستخدام نظم الفيروسة الألفاوية transducing صحفيين للتعبير عن فلوري في التجارب المختبرية والبعوض البالغ. ويمكن تكييف هذه التقنية للتعبير عن أي مصلحة من البروتين بدلا من أو بالإضافة إلى أحد الصحفيين.
الفيروسة الألفاوية نظم transducing (ATSs) هي أدوات مهمة للتعبير عن الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) خلال العدوى. وتستمد من استنساخ [كدنا] ATSs من الفيروسات التي تنتقل عن طريق البعوض الحمض النووي الريبي (جنس الفيروسة الألفاوية ؛ عائلة الفيروسات الطخائية). جنس الفيروسة الألفاوية يحتوي على حوالي 30 نوعا مختلفا فيروس ينقله البعوض. Alphaviruses هي فيروسات يلفها واحدة تحتوي على الحمض النووي الريبي الجينوم الذين تقطعت بهم السبل (~ 11.7 كيلو بايت). Alphaviruses تدوين a مرنا subgenomic التي بترميز البروتينات الهيكلية للفيروس اللازمة لEncapsidation للجينوم ونضوج الفيروس. وعادة ما تكون Alphaviruses lytic عالية في خلايا الفقاريات ، ولكن بإصرار تصيب الخلايا البعوض عرضة الباثولوجيا الخلوية مع الحد الأدنى. هذه الصفات تجعلها أدوات ممتازة للتعبير الجينات في البعوض الناقل. تستمد ATSs الأكثر شيوعا في الاستخدام من فيروس سندبيس (SINV). واسعة من الأنواع tropism SINV يسمح للعدوى من cells8 الحشرات ، والطيور ، والثدييات. ومع ذلك ، فقد استمدت من ATSs alphaviruses 9،10،20 الأخرى أيضا. يرصد الأجنبية التعبير الجيني ممكن عن طريق إدخال إضافي موقع subgenomic الفيروسي RNA أو الشروع المروج. يستخدم ATSs التي يتم وضع تسلسل الجينات الخارجية 5 'إلى الجينات الهيكلية للتعبير البروتين الفيروسي مستقرة في الحشرات. يستخدم ATSs ، الذي يتوضع على تسلسل الجين 3 'إلى الجينات الهيكلية ، لتحريك ورني الصمت تعبيرا عن هذا الجين في الحشرات.
وقد أثبتت ATSs إلى أن تكون أدوات قيمة لفهم التفاعلات ناقلات الممرض ، وتفاصيل الجزيئي للتكاثر الفيروس ودورات الصيانة 3،4،11،19،21 المعدية. على وجه الخصوص ، وقد تم التعبير عن صحفيين الفلورسنت وbioluminescent مفيدة تتبع عدوى فيروسية في انتقال الفيروس وناقلات 5،14-16،18. بالإضافة إلى ذلك ، فقد وصفت الاستجابة المناعية باستخدام ناقلات سلالتين من SINV هندسيا للتعبير عن 2،9 GFP.
هنا ، فإننا نقدم وسيلة لإنتاج SINV تحتوي مراسل فلوري (GFP) من استنساخ [كدنا] المعدية. هو كتب المعدية ، وكامل طول الحمض النووي الريبي من استنساخ [كدنا] الخطي. هو عرض المعدية RNA في الخلايا المستهدفة المتساهلة التي electroporation. خلايا Transfected توليد جزيئات الفيروس المعدية معربا عن الحكومة العراقية. ويستخدم الفيروس ليصيب البعوض تحصد ، كما هو موضح هنا ، أو الأنواع المضيفة الأخرى (لا يظهر هنا). ويتم تقييم الكفاءة عن طريق الكشف عن ناقلات مضان خارج المعى المتوسط أو عن طريق انتقال الفيروس رصد 7. استخدام مراسل الفلورسنت كما يسمح للحكومة العراقية لتقدير ملاءمة لانتشار الفيروس في جميع أنحاء ثقافة الخلية ، لتحديد معدل نشر ، والعدوى في البعوض المكشوفة ، وانتقال الفيروس من البعوض ، ويوفر مقياسا السريع المتجه من الكفاءة.
قدم هنا طرق تمكين الباحثين من متابعة إصابة الألفاوية في الثقافة خلية البعوض والحشرات البالغات. وفيما يلي موجز لمزايا ومساوئ استخدام الفيروسات المنشطات في الجدول 2. يمكن أن يكون استنساخ ATS المعدية التلاعب وراثيا للتعبير عن أي الحكومة الإسرائيلية والتي استخدمت للتعبير عن الأضداد سلسلة واحدة ، من المكثفات رني ، الرناوات العقاقير استهداف الجينات الذاتية ، والبروتينات الموالية لأفكارك. إذا لم يتم استخدام مراسلة ، ثم جزء من التصوير هذه الطريقة ليست ذات الصلة. ومع ذلك ، فإن العديد من البروتوكولات ذاتها ضرورية لانقاذ فيروس المنشطات ، ونشر ، والعدوى من البعوض. هناك قيود في حجم القصوى من التحوير عند إدراجها في نظام الألفاوية transducing. المعوقات تختلف تبعا لحجم السلالة الأبوية المستخدمة لتوليد المنشطات ، ولكن عادة ما تكون حول 1KB على الرغم من استخدام الجينات أكبر مراسل luciferase مثل يراعة في بناء المنشطات لاستخدامها في البعوض. وينبغي أن مختبرات الأبحاث مع مبلغ متواضع من الفيروسات الخلفية تكون قادرة على استخدام المنشطات عقب هذه البروتوكولات. وقد قام عدد من المختبرات البحثية بالفعل باستخدام SINV القائم على المنشطات و.
The authors have nothing to disclose.
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH R01 AI46435) وRMRCE (NIH AI065357).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | ||
MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. | |
Cap Analogue (m7G(5′)ppp(5′)G) | Ambion | AM8050 | ||
Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | ||
Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |