Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Het volgende protocol is geschreven voor de productie en het gebruik van een ATS op basis van de Sindbis virus MRE16. De ATS is ontworpen om GFP te drukken in de mug vector Aedes aegypti. cDNA Infectieuze klonen van een aantal alphaviruses (Sindbis virus, Chikungunya virus, O'nyong-Nyong virus, western paarden encephalitis virus) zijn op dit moment verkrijgbaar die zijn ontworpen als ATS's (tabel 1). Voor het beste resultaat plasmide DNA wordt versterkt in bacteriën zoals SURE bevoegde bacteriën (Stratagene / Agilent Technologies) om ongewenste recombinatie en het verlies van het virale cDNA te vermijden. Alle besmettelijke kloon plasmiden hebben een bacteriofaag T7 of SP6 promotor aan de onmiddellijke 5 'uiteinde van het virale cDNA voor de transcriptie van de volledige lengte genomisch RNA en een unieke restrictie endonuclease aan het 3' einde voor afvoer transcriptie. Voor elke ATS, moeten gebruikers gebruik maken van de juiste bacteriofaag DNA-afhankelijke RNA polymerase en unieke restrictie-endonuclease voor in vitro transcriptie van het virale RNA genoom. 1. Generatie van infectieuze RNA uit cDNA-kloon. Lineariseren de 5μg van de besmettelijke kloon plasmide (p5'dsMRE16 / GFP) met 20 eenheden van Xhol restrictie-enzym in een 100 ul reactie. Incubeer 2-3u bij 37 ° C Zuiver gelineariseerde DNA met behulp van Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternatieve zuivering protocol, elueren DNA van spin-kolom met 50 pi RNase-vrij water. Plasmide concentratie moet ongeveer 1,0 g / ul. In een RNase-vrij 0,2 ml PCR-buizen, set-up een 50 pi transcriptie reactie met gebruikmaking van Ambion MAXIscript Kit per protocol als volgt. 22,5 pi RNase-vrij dH 2 O 5,0 pi Gelineariseerde DNA-template (1,0 ug / ul) 2,5 pi 10 mM ATP 2,5 pi 10 mM CTP 2,5 pi 10 mM UTP 2,5 pi 1 mM GTP 2,5 pi 10 mM cap analoge (m 7 G (5 ') ppp (5') G) 5,0 ul 10X transcriptie buffer 5,0 pi T7 of SP6 polymerase mix 50,0 uL Totaal Incubeer de transcriptie reactie gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na de incubatie moet de reactie onmiddellijk worden gebruikt voor elektroporatie van de BHK-21 cellen. Voorbereiding van de BHK-21 cellen voor elektroporatie moet beginnen tijdens de incubatie transcriptie reactie. 2. Generatie van Virus van Infectieuze RNA Trypsinize twee 70-80% samenvloeiende 150 cm 2 (T-150) flesje BHK-21 cellen per ATS. Breng alle cellen om een ​​15 ml conische centrifugebuis. Pellet de cellen door centrifugeren bij 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in een conventionele tafelblad centrifuge. Resuspendeer cellen in steriele PBS zonder Mg + + en Ca + +. Herhaal de stappen 2.3 en 2.4 tot de cellen zijn drie keer gewassen met PBS. Resuspendeer de gepelleteerde cellen 0,5 ml MEM met 10% FBS. Verdun 10 pi cellen met een 90 microliter MEM met 10% FBS en rekenen op een hemacytometer. Indien nodig, verdunnen cellen 2.5-12.5 x 10 7 cellen / ml met MEM dat 10% FBS. Om een ​​ijskoude 0,2 cm elektroporatie cuvette, voeg 400 pi celsuspensie en 20 pi transcriptie reactie. Veeg condens van de cuvette. Pulse de cuvet twee keer: 450V, 1200Ω, 150 uF. We maken gebruik van een Electro Cell Manipulator, Harvard Apparatuur Model ECM630. Plaats de gehele inhoud van de cuvet in een 25 cm 2 weefselkweek kolf met 5 ml MEM met 10% FBS. Incubeer kolf (s) bij 37 ° C met 5% CO 2. Dagelijks toezicht op de infectie met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop met een geschikte filter set (bijvoorbeeld GFP filter: excitatie golflengte = 460-490 nm, emissie golflengte = 510-550 nm, of DsRed filter: excitatie golflengte = 460-560 nm, emissie golflengte => 590 nm). Bij de fluorescentie suggereert infectie is samenvloeiend en / of CPE is zichtbaar in de fles, het verzamelen van de inhoud van de kolf, voeg 30% FBS, hoeveelheid zo nodig en bewaar bij -80 ° C. Indien gewenst, kan cellysaten worden gewist door centrifugatie (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) voorafgaand aan de toevoeging van FBS. Passage virus ten minste een keer door middel van een nieuwe fles van cellen om het virus titer verhoging voor de volgende bloed voeden assays. 3. Per os Infectie van Muggen Meng het bloed (meestal gekocht de-fibrinated schapen bloed) en cel-cultuur afgeleid virus schorsing vanaf stap 2.13. Laatste virus titer in het bloed maaltijd meestal moet worden ~ 1×10 7 plaque-vormende eenheden (pfu) / ml voor een efficiënte middendarm infectie van de mug. Het stimuleren van muggen te snel te vullen, adenosine 5'-trifosfaat (ATP) kan worden toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 0,02 miljoen. Muggen kunnenmoeten worden beroofd van water en suiker vóór infectie om hen te stimuleren om efficiënt bloed voeden van een kunstmatige feeder. Duur van de armoede moet vooraf worden vastgesteld om de sterfte te minimaliseren. Keer zal afhangen van muggensoorten, vochtigheid van de insectary enz. Als uitgangspunt, verwijder suiker 24u en 12u water voorafgaand aan het voer. Dit protocol maakt gebruik van watermantel glas feeders17 met circulerende 37 ° C water. Een varkens intestinale membraan (dat wil zeggen grondig gewassen worst behuizing verkrijgbaar bij de meeste supermarkten) is geplaatst over de monding van de feeder en de maaltijd wordt gepipetteerd in de kamer. Diverse uitvoeringen, membranen en protocollen zijn beschikbaar voor verschillende vector types. Muggen worden gesorteerd om alleen die muggen volgezogen met bloed te selecteren. Gezwollen muggen worden overgebracht naar een doos met organdie op de bovenkant en de muggen worden geïncubeerd bij 28 ° C, 75-80% relatieve vochtigheid Tot de verwerking voor GFP expressie. 4. Intrathoracale Enten van Muggen Intrathoracale enting is een alternatieve methode voor het infecteren van de geleedpotige. Deze methode wordt gebruikt wanneer de verspreiding via de middendarm is niet vereist. (Methode hieronder beschreven, maar de techniek wordt niet weergegeven in dit visuele experiment). Een klein aantal van de muggen (5-10) wordt opgezogen uit het bedrijf kooien in plastic holding buizen. De verzegelde holding buisjes geplaatst worden bij 4 ° C gedurende 15 min om de muggen chill. 2 5 muggen wordt gemorst uit de tube op een glazen petrischaal rust op het ijs. Plaats het deksel op de petrischaal wanneer het niet gebruikt of als er muggen beginnen te bewegen. Tijdens de behandeling van de muggen, moeten maatregelen genomen worden om te tellen en bij te houden van het aantal muggen gemanipuleerd. Omdat muggen worden gemorst op de tafel chill, zal het totale aantal opgenomen worden op een lab teller. De naald wordt bereid door het smelten van capillaire buis met behulp van Nanoject specifieke glas en een naald trekker. Het instellen van de Nanoject II microinjector per instructies van de fabrikant voor de levering van 69 nL inoculum. Zorg moet worden betracht bij het tekenen van de inoculum in de naald, zodat de naald niet beschadigd is. Met behulp van een dissectiemicroscoop, steek de naald in de borstkas van de mug en activeer de Nanoject voor de inenting. Zorg moet worden betracht bij het inenten van muggen, zodat de naald niet volledig doordringen in de mug en verlaat de andere kant, resulterend in de daaropvolgende dood van de mug. Controleer elke mug om er zeker van dat de entstof ingevoerd voordat u deze uit de naald. Na inoculatie, terwijl de mug nog gespietst op de naald, plaats het in een papieren doos houden door een klein gaatje in de zijkant die is aangesloten met katoen of een kurk stop op alle andere tijden. Als de muggen hebben geïnoculeerd en geplaatst in de doos (tot ongeveer 50 per doos), zorgvuldig tape de kurk op zijn plaats per ongeluk vrijkomen van de muggen te voorkomen. Plaats de dozen in een veilige holding bak voor verdere incubatie in de insectary bij 28 ° C en 80% relatieve vochtigheid. 5. Monitoring Infectie van Muggen Plaats het papier holding doos bij 4 ° C gedurende ongeveer 15 minuten om muggen te immobiliseren. Overdracht van een klein aantal muggen (5-10 per keer) om een ​​chill tabel aangepast voor gebruik op een fluorescentiemicroscoop. Onderzoeken en sorteren muggen op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van fluorescentie. Daarnaast kan fluorescentie-intensiteit worden gebruikt als een proxy kwantitatieve meting van de infectie. Mug weefsels zoals midguts, speekselklieren, kan dik lichaam worden ontleed en gecontroleerd voor fluorescentie. Indien nodig, terug geselecteerde muggen om papier te bewaren ter incubatie van geïnfecteerde muggen voort te zetten. 6. Transmission Assay (gedwongen speekselen tot overdracht van het virus te tonen) Ontnemen muggen van suiker bron voor de 24 uur voorafgaand aan de feed. Verwijder de poten en vleugels Om een ​​50 ul capillair dat is verwarmd, getrokken en geknipt aan de ene kant, voeg 3-5 ul Cargille Type B immersie olie of 10% serum-sucrose-oplossing. Steek de snuit in de buis. Bij gebruik van olie, zal druppeltjes speeksel worden gezien als stralen uit de proboscis. Een pi van een 1%-oplossing pilocarbine in PBS en 0,1% Tween 80 kan worden toegepast op de thorax te stimuleren. Na 60-90 minuten, verwijder muggen en op te slaan voor virusisolatie indien nodig. Verwijder oplossing uit de tube door centrifugeren in een buisje met 100 ul 20% FBS-PBS. Steriel filter het inoculum door een 0,2 um spuitfilter en gebruik dan de gefilterde de inoculum om gekweekte cellen te infecteren. BIOVEILIGHEID LET OP: Dit protocol beschrijfteen methode voor het genereren, het identificeren en monitoren besmette muggen. Op basis van uw faciliteiten (dat wil zeggen een chill tafel, containment facility, enz.) en IBC goedkeuring, kunt u worden beperkt tot het onderzoek van hen alleen na het verwijderen van vleugels en poten om ontsnapping te voorkomen. SINV op basis van ATS's kunnen worden gegenereerd en gebruikt worden in een BSL2 omgeving. Het gebruik van de ATS is gebaseerd op andere alphaviruses, zoals Chikungunya-virus of western paarden encephalitis virus vereist BSL3 faciliteiten. 7. Representatieve resultaten Een overzicht van de expressie van een marker-gen (GFP) met behulp van de ATS 5'dsMRE16 / GFP is weergegeven in figuur 1. Expressie van GFP in BHK-21 en C6/36 (Aedes albopictus) cellen is weergegeven in figuur 2 op bepaalde tijden na de infectie van cellen met 5'dsMRE16 / GFP virus op 0,01 multipliciteit van infectie. Figuur 3 is een overzicht van de Alphavirus en ATS virus infectie in de mug wanneer het virus wordt geleverd door middel van een infectieuze bloedmaaltijd. Figuur 4 toont de voorbereiding van een bloedmaaltijd met ~ 10 7 pfu / ml ATS virus gevolgd door een orale infectie van Aedes aegypti. Hele lichaam te bekijken van de geïnfecteerde mug en geselecteerde delen van het lichaam op 10 dagen na de infectie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop (figuur 5). Detectie van GFP en DsRed in midguts van geïnfecteerde muggen na infectie met ATS 5'dsMRE16 virussen uiten van elk fluorescente marker-gen (Figuur 6). Transmissie-test met behulp van muggen die besmet zijn met 5'dsMRE16 / GFP ATS virus (figuur 7). Tabel 1. ATS is op dit moment ontwikkeld voor genexpressie in muggen.   Alphavirus ATS Mug Referentie Sindbis Virus TE / 3'2J en TE / 5'2J Aedes aegypti 12 Ochlerotatus triseriatus 13 3'dsMRE16 en 5'dsMRE16 A. aegypti 5 Culex tritaeniorhynchus 5 5'dsTR339 A. aeg ypti 2 Chikungunya-virus 3'dsCHIKV en 5'dsCHIKV A. aegypti / A. albopictus 20 O'nyong Nyong virus 5'dsONNV Anopheles gambiae 1,9 West-equine encephalitis virus 5'dsWEEV. McMillan Culex tarsalis Stauft et al.., Ongepubliceerde Tabel 2. Voordelen / nadelen van het gebruik van ATS voor genexpressie in muggen. Voordelen: Snelle productie van high-titer virus Breed gastheerbereik (SINV) Hoog RNA replicatie-tarief Hoge transgen expressie niveaus Relatieve gemak van het manipuleren van genen Stabiel, aanhoudende genexpressie bij insecten Minimale pathologie bij insecten Nadelen: Op korte termijn expressie mode in gewervelde cellen Sterke cytopathische effecten op gewervelde cellen Gene grootte beperkingen (<1kb, ideaal) Sommige alphaviruses vereisen BSL3 insluiting Figuur 1: Overzicht van ATS virus productie in BHK-21 cellen met behulp van p5'dsMRE / GFP SINV uiten van GFP. Naar aanleiding van in vitro transcriptie, is genomische ATS RNA geëlektroporeerd in BHK-21 cellen waar het virus is gered. De ATS virus kan dan gebruikt worden om muggen te infecteren. SGP = subgenome promotor. Drie ATS RNA soorten zijn getranscribeerd in de cells, de genomische, subgenome 1 en 2 subgenome RNAs. C (capside), zijn E2 en E1 glycoproteïnen geassembleerd met ATS genoom aan besmettelijke virus te genereren. Figuur 2: Expressie van GFP in mug (C6/36) cellen na infectie met SINV 5'dsMRE16 / GFP virus. Figuur 3: Overzicht van een ATS-virusinfectie in muggen leidt tot virusoverdracht. Figuur 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infectie door het blootstellen van muggen aan een infectieuze bloedmaaltijd. Figuur 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infectie op 10 dagen na infectie. Hele lichaam detectie van GFP toont aan dat virus is ontsnapt aan de middendarm en verspreid naar secundair weefsels. Figuur laat ook zien GFP expressie in bepaalde lichaamsdelen die ook duidt op een gedissemineerde infectie. Figuur 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP en 5'dsMRE16 / DsRed infectie van midguts op bepaalde tijdstippen na infectie. Midguts hebben meestal verschillende brandpunten van besmetting vroeg na het innemen van een bloed-maaltijd met virus dat zich verspreidt door de achterste middendarm op latere tijdstippen post-infectie. Figuur 7: Detectie van ATS 5'dsMRE16 / GFP in de mug speeksel zo vroeg acht dagen na infectie. Test is ontworpen om de overdracht van de ATS virus en laat zien dat de 5'dsMRE16 / GFP virus stabiel kan GFP gedurende de extrinsieke incubatietijd in de mug te drukken show. Het linker paneel toont een mug kwijlen in een capillaire buis, het centrum paneel toont C6/36 cellen die geïnfecteerd zijn met speeksel op 1 dag en rechter paneel 3 dagen na infectie.