Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Aşağıdaki protokol Sindbis virüs MRE16 dayalı bir ATS üretimi ve kullanımı için yazılmıştır. ATS, sivrisinek vektörü Aedes aegypti GFP ifade etmek için tasarlanmıştır . alpha virüsleri bir dizi (Sindbis virüs, Chikungunya virüsü, O'nyong nyong virüs, Batı at ensefaliti virüsü) Enfeksiyon cDNA klonları ATS (Tablo 1) olarak tasarlanmış olduğunu şu anda mevcuttur. En iyi sonuç için plazmid DNA istenmeyen rekombinasyon ve viral cDNA kaybı önlemek için EMİN yetkili bakteri (Stratagene / Agilent Technologies) gibi bakteri yükseltilir. Tüm bulaşıcı klon plazmid, ikinci tur transkripsiyon için sonunda tam uzunlukta genomik RNA transkripsiyonu ve 3 eşsiz bir kısıtlama endonükleaz viral cDNA sonu acil 5 bakteriyofaj T7 veya SP6 promoter var. Her bir şebeke için, kullanıcıların uygun bakteriyofaj DNA bağımlı RNA polimeraz ve viral RNA genomu in vitro transkripsiyon için benzersiz kısıtlama endonükleaz kullanmanız gerekir . 1. CDNA Aynısını Enfeksiyon RNA nesil. 20 adet 100 mcL reaksiyon XhoI restriksiyon enzimi ile (p5'dsMRE16 / GFP) plazmid bulaşıcı bir klon 5μg Linearize. 2-3h inkübe 37 ° C 50 mcL RNaz içermeyen su kullanarak spin kolon DNA salınımlı Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternatif arıtma protokolü kullanarak Lineerleştirilmiş DNA arındırın. Plazmid konsantrasyonu yaklaşık 1.0 mg / ml olmalıdır. RNaz-free 0,2 ml PCR tüpü, set-up protokol başına Ambion MAXIscript Takımı kullanarak 50 mcL transkripsiyon reaksiyon aşağıdaki gibidir. 22.5 mcL RNaz ücretsiz dH 2 O 5.0 mcL Doğrusallaştırılmış DNA örneğinin (1.0 mikrogram / ml) 2.5 mcL 10mM ATP 2.5 mcL 10mM CTP 2.5 mcL 10mM UTP 2.5 mcL 1mm GTP 2.5 mcL 10mM kap analog (m 7 G (5 ') ppp (5) G) 5.0 mcL 10X transkripsiyon tampon 5.0 mcL T7 veya SP6 polimeraz karışımı 50.0 mcL Toplam 37 1 saat için transkripsiyon reaksiyonu inkübe ° C. Inkübasyondan sonra, BHK-21 hücre reaksiyonu elektroporasyon için hemen kullanılabilir olmalıdır. Elektroporasyon BHK-21 hücrelerinin hazırlanması inkübasyon transkripsiyon reaksiyonu sırasında başlamalıdır. 2. Enfeksiyon RNA Virüs Üretimi Konfluent 150 cm 2 (T-150) ATS ortalama balon BHK-21 hücreleri iki% 70-80 Trypsinize. Tüm hücreleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Pelet 2000 rpm'de santrifüj hücreleri, 10 dk, 4 ° C geleneksel bir masaüstü santrifüj. Olmadan steril PBS yeniden süspanse hücreleri Mg + + ve Ca + +. Hücreler PBS ile üç defa yıkanır kadar 2.3 ve 2.4 adımları tekrarlayın. % 10 FBS içeren pelet hücreleri 0.5 ml MEM tekrar 10 mcL hücrelerin% 10 FBS 90 mcL MEM ile seyreltilir ve bir hemasitometre güvenebilirsiniz. Eğer gerekli MEM% 10 FBS içeren 2,5-12,5 x 10 7 hücre / mL seyreltik hücreleri. Buz gibi 0.2 cm elektroporasyon küvet, 400 mcL hücre süspansiyonu ve 20 mcL transkripsiyon reaksiyonu ekleyin. Küvet gelen yoğuşma silin. 450V, 1200Ω, 150 μF: iki kez küvet Darbe. Biz Electro Hücre Manipulator, Harvard Apparatus Model ECM630 kullanın. Küvet tüm içeriğini% 10 FBS ile 5 ml MEM içeren bir 25 cm 2 doku kültürü şişesi içine yerleştirin. % 5 CO 2 ile 37 ° C'de inkübe balonuna (ler). Dalgaboyu 460-490 nm, emisyon dalga boyu 510-550 nm veya filtre dsRed: uygun filtre seti (örneğin GFP filtre ters bir floresan mikroskop kullanılarak günlük enfeksiyon Monitör dalgaboyu 460-560 nm, emisyon dalga boyu => 590 nm). Floresan enfeksiyon belirsiz ve / veya CPE şişesi boyunca görülebilir önerdiğinde, -80 gerekli ve mağaza olarak, kısım, balonun içeriği toplamak% 30 FBS eklemek ° C Eğer istenirse hücre lizatları (2000 rpm, 10 dakika, 4 ° C) FBS ek olarak önce santrifüj yoluyla temizlenir. Passage sonraki kan beslenme deneyleri için virüs titresi artırmak için yeni bir balon hücreleri ile en az bir kere virüs. Sivrisinekler 3 başına os Enfeksiyon Kan (genellikle de fibrinated koyun kanı satın) ve adım 2.13 hücre kültürü elde virüs süspansiyonu birlikte karıştırın. Kan öğünde Final virüs titresi genellikle ~ 1×10 7 plak oluşturan birim (pfu) sivrisinek verimli midgut enfeksiyon / mL olmalıdır. Tıkamak, 5'-trifosfat (ATP) adenozin sivrisinek teşvik etmek 0.02M bir final konsantrasyon eklenebilir. Sivrisinekler olabiliryapay bir besleyici verimli kan beslemek için onları teşvik etmek için enfeksiyondan önce su ve şeker yoksun bırakılamaz. Mortaliteyi en aza indirmek için mahrumiyet süresi daha önce tesis edilmelidir. Times, sivrisinek türleri, bir başlangıç ​​noktası olarak insectary vb nem bağlıdır, şeker 24 yem ve su 12 saat önce kaldıracaktır. Bu protokol, 37 ° C su ile dolaşımdaki su ceketli cam feeders17 kullanır. Domuz bağırsak zarı (yani en bakkalları iyice kasa sosis yıkanmış), besleyici ve yemek odasının pipetlenir ağız üzerine yerleştirilir. Farklı vektör türleri için çeşitli tasarımlar, membranlar ve protokolleri mevcuttur. Sivrisinekler kan ile tıkanmış sivrisinek seçmek için sıralanır. Engorged sivrisinek üstüne organze ile bir karton transfer ve sivrisinek 28 inkübe ° C,% 75-80 bağıl nem, GFP ifade için işlenmiş kadar. 4. Sivrisinekler, intratorasik Aşılama Intratorasik aşılama eklembacaklıların bulaşmasını için alternatif bir yöntemdir. Midgut yoluyla yayılması gerekli değildir bu yöntem kullanılır. (Yöntem aşağıda açıklanan ancak bu görsel deney tekniği değildir). Sivrisinek az sayıda (5-10), plastik tüp içine taşıyan holding kafeslerden aspire edilir. 15 dakika sivrisinekler soğuk ° C kapalı tutarak tüpler 4 alınacaktır. 2 5 sivrisinek tüpten buz üzerinde duran bir cam petri üzerine dökülen olacaktır. Kullanımda değil veya sivrisinek hareket etmeye başlar Petri kabı kapağı yerleştirin. Sivrisinek taşınması sırasında, bakım değiştirilmekte olan sivrisineklerin sayıda parça sayısı ve tutmak için alınmalıdır. Sivrisinekler soğuk masaya dökülen, toplam sayısı bir laboratuar karşı kaydedilecektir. Iğne Nanoject özel cam ve bir iğne çektirmenin kullanılarak kılcal boru eriterek hazırlanmıştır. 69 nL inokulum teslimat için üreticinin talimatlarına göre Nanoject II mikroenjektör Kur. Iğne iğne hasarlı olup olmadığını böylece inokulum çizerken dikkatli olmak gerekir. Diseksiyon mikroskop kullanarak, sivrisinek toraks içine iğne takın ve aşılama için Nanoject etkinleştirmek. Iğne sivrisinek tamamen nüfuz ve sivrisinek sonraki ölümle sonuçlanan, diğer tarafta çıkmak değildir, böylece sivrisinek aşılama zaman dikkatli olmak gerekir. Inokulum iğneden çıkarmadan önce girdiğinizden emin olmak için her sivrisinek kontrol edin. Sivrisinek hala iğne kazığa ise aşılama sonra, pamuk veya diğer tüm zamanlarda bir tıpa ile takılı yan tarafındaki küçük bir delikten bir kağıt tutarak karton yerleştirin. Sivrisinek dikkatle karton (yaklaşık 50 kadar karton başına), bant sivrisinek yanlışlıkla serbest bırakılmasını önlemek için mantar inoküle ve yer var. 28 ° C ve% 80 bağıl nem insectary daha inkübasyon önce güvenli bir holding bin karton yerleştirin. 5. Sivrisinekler, İzleme Enfeksiyon 4 ° C'de yaklaşık 15 dakika boyunca sivrisinek hareketsiz tutarak karton kağıt yerleştirin. Sivrisinek az sayıda (bir seferde 5-10), floresan mikroskop kullanmak için uyarlanmış bir ürperti tabloya aktarın. Floresan varlığı ya da yokluğu dayalı sivrisinek inceleyin ve sıralama. Ayrıca, floresan yoğunluğu bir proxy kantitatif ölçümü gibi enfeksiyon olabilir. Midguts, tükürük bezleri gibi Sivrisinek doku, yağ vücut floresan disseke ve izlenir olabilir. Eğer uygunsa, enfekte olmuş sivrisinek inkübasyon devam seçilen sivrisinek kağıt karton geri dönün. 6. İletim Assay (Virüs İletim sergilemek için Zorla Sekresyon) Önce 24 saat beslemek için şeker kaynağı sivrisinek mahrum. Bacaklarını ve kanatlarını çıkartın Bir ucunda, ısıtmalı çekti ve snipped olmuştur 50 mcL kılcal tüp, Cargille B Tipi immersiyon ya da% 10 serum sakaroz çözeltisini 3-5 mcL ekleyin. Burnumun tüp içine yerleştirin. Yağ kullanıyorsanız, tükürük damlacıkları burnumun terlemek görülecektir. PBS içinde% 1 pilocarbine çözüm ve% 0.1 Tween 80 mcL uyarmak için toraks uygulanabilir. 60-90 dakika sonra, sivrisinek kaldırmak ve gerekirse virüs izolasyonu için mağaza. 100 mcL% 20 FBS-PBS içeren bir tüp santrifüj tüpten çözüm çıkarın. Sonra steril filtre 0.2 mikron şırınga filtresi aracılığıyla inokulum ve kültür hücreleri enfekte etmek için filtrelenmiş inokulum kullanın. BİYOGÜVENLİK NOT: Bu protokol açıklarenfekte sivrisinek üreten belirlenmesi ve izlenmesi için bir yöntem. Fasiliteler (yani bir ürperti tablosu, çevreleme tesis, vb) ve IBC onayına dayanarak, sadece kaçmasını önlemek için kanatlarını ve bacaklarını ayıkladıktan sonra onları inceleyerek sınırlı olabilir. SINV-tabanlı ATS oluşturulur ve BSL2 bir ortamda kullanılabilir. ATS Chikungunya virüs ya da Batı at ensefaliti virüsler gibi diğer alpha virüsleri dayalı BSL3 tesisleri gerekecektir. 7. Temsilcisi Sonuçlar ATS 5'dsMRE16 / GFP kullanarak bir marker gen (GFP) ifadesi bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. BHK-21 ve C6/36 (Aedes albopictus) hücreleri GFP ekspresyonu enfeksiyon sonrası enfeksiyon 0.01 çokluğu 5'dsMRE16 / GFP virüs hücreleri belirli zamanlarda Şekil 2'de gösterilmiştir. Şekil 3, virüs, bir enfektif kan yemek boyunca teslim sivrisinek alphavirus ve ATS virüs enfeksiyonu genel bir bakış. Şekil 4 Aedes aegypti ağız enfeksiyonu takiben ATS virüs ~ 10 7 pfu / ml kan yemek hazırlama gösterir. Tüm vücut görünümü Epifloresans bir mikroskop kullanılarak (Şekil 5) Enfekte sivrisineğin ve 10 gün sonrası enfeksiyonu seçilen vücut parçaları. GFP Algılama ve her floresan işaretleyici gen (Şekil 6) ifade ATS 5'dsMRE16 virüsü ile enfeksiyonu takiben enfekte sivrisinek midguts içinde dsRED. İletim tahlil 5'dsMRE16 / GFP ATS virüsü (Şekil 7) ile enfekte sivrisinek kullanarak. Tablo 1: ATS henüz sivrisinek gen ekspresyonu için tasarlanmıştır.   Alphavirus ATS Sivrisinek Referans Sindbis Virüs TE / 3'2J ve TE / 5'2J Aedes aegypti 12 Ochlerotatus triseriatus 13 3'dsMRE16 ve 5'dsMRE16 A. aegypti 5 Culex tritaeniorhynchus 5 5'dsTR339 A. AEG ypti 2 Chikungunya virüsü 3'dsCHIKV ve 5'dsCHIKV A. aegypti / A albopictus 20 O'nyong nyong virüsü 5'dsONNV Anofel gambiae 1,9 Batı at ensefaliti virüsü 5'dsWEEV. McMillan Culex tarsalis Stauft ve ark. Yayınlanmamış Tablo 2 sivrisinek gen ekspresyonu için ATS kullanmanın avantajları / dezavantajları. Avantajları: Yüksek titrede virüs hızlı bir şekilde üretim Geniş ev sahibi aralığı (SINV) Yüksek RNA replikasyon oranı Yüksek transgen ekspresyon düzeyleri Manipüle genlerin göreceli kolaylığı Böceklerde istikrarlı, kalıcı gen ekspresyonu Minimal patoloji böceklerde Dezavantajları: Kısa vadeli omurgalı hücrelerinde ifade modu Omurgalı hücreler üzerinde güçlü sitopatik etkileri Gen boyutu kısıtlamaları (<1 kB'lık, ideal) Bazı alpha virüsleri BSL3 çevreleme Şekil 1: p5'dsMRE / GFP SINV ifade GFP kullanarak BHK-21 hücre ATS virüs üretim Genel Bakış. In vitro transkripsiyon ardından, genomik ATS RNA virüsü kurtarılır BHK-21 hücre içine electroporated. ATS Virüs daha sonra sivrisinek enfekte için kullanılabilir. SGP = subgenomic organizatörü. Üç ATS RNA türlerinin cel transkripsiyonuls, genomik, subgenomic 1 ve 2 RNA'lar subgenomic. C (kapsid), E2 ve E1 glikoproteinler, bulaşıcı bir virüs ATS genomu üretmek için ile monte edilir. Şekil 2: İfade hücreleri SINV 5'dsMRE16 / GFP virüs enfeksiyonunu takiben sivrisinek GFP (C6/36). Şekil 3: Genel Bakış virüs iletim önde gelen sivrisinek ATS virüs enfeksiyonu. Şekil 4: ATS SINV bir enfektif kan yemek sivrisinek açığa 5'dsMRE16 enfeksiyon. Şekil 5: 10 gün enfeksiyonu ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP enfeksiyon. GFP Tüm vücut algılama bu virüs midgut kaçtı ve ikincil dokulara dağıtılmıştır gösterir. Şekil aynı zamanda yaygın bir enfeksiyon göstergesidir seçilen vücut parçaları, GFP ifade gösterir. Şekil 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP ve 5'dsMRE16 / midguts belirli zamanlarda enfeksiyon sonrası dsRED enfeksiyon. Midguts genellikle erken, daha sonraki dönemlerde enfeksiyon sonrası posterior midgut yayılır kan yemek içeren virüs yuttuktan sonra enfeksiyon farklı odaklar var. Şekil 7: 8 gün sonrası enfeksiyon gibi erken bir zamanda ATS 5'dsMRE16 / sivrisinek tükürük GFP Algılama. Testi ATS virüs ve 5'dsMRE16 / GFP virüs stably sivrisinek ekstrensek kuluçka dönemi boyunca, GFP ifade gösterir iletim göstermek için tasarlanmıştır. Sol panelinde, kılcal bir tüp içine salivating bir sivrisinek gösterir, merkez paneli, 1 gün ve sağ panel 3 gün enfeksiyonu tükürük ile enfekte C6/36 hücreleri gösterir.