Groei en differentiatie van volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn neurale stamcellen
Summary
Neurale stamcellen werden bereid uit de hippocampus van de volwassen niet-winterslaap jaarling Arctic grondeekhoorns (AGS). Deze neurale stamcellen kan worden uitgebreid door middel van talrijke passages, gedifferentieerde en onderhouden als een bijna 50:50 neuron te glia-cultuur.
Abstract
Arctic grondeekhoorns (Urocitellus parryii, AGS) zijn uniek in hun vermogen om te overwinteren met een lichaamstemperatuur de buurt van of onder het vriespunt 1. Deze dieren ook verzetten tegen ischemische schade aan de hersenen in vivo 2,3 en zuurstof-glucose ontbering in vitro 4,5. Deze unieke kwaliteiten op voorwaarde dat de impuls gegeven aan AGS neuronen te isoleren om de inherente neuronale eigenschappen die zou kunnen zijn voor de capaciteit van de AGS neuronen om letsel en celdood veroorzaakt door ischemie en extreem lage temperaturen weerstaan onderzoeken. Het identificeren van eiwitten of genen doelstellingen die het mogelijk maken voor de onderscheidende eigenschappen van deze cellen kunnen helpen bij de ontdekking van effectieve therapieën voor een aantal van ischemische indicaties en voor de studie van koude tolerantie. Volwassen AGS hippocampus bevat neurale stamcellen die blijven prolifereren, waardoor voor een gemakkelijke uitbreiding van deze stamcellen in een kweek. We beschrijven hier methodes waarmee onderzoekers kunnen deze stamcellen en gedifferentieerde neuronen te gebruiken voor een aantal doeleinden. Door nauw samen de volgende stappen van de AGS neurale stamcellen kan worden uitgebreid via twee doorgangen of meer en dan gedifferentieerd om een cultuur hoog in TUJ1-positieve neuronen (~ 50%), zonder gebruik te maken van giftige chemicaliën om het aantal delende cellen te minimaliseren. Ischemie veroorzaakt neurogenese 6 en neurogenese, die verloopt via MEK / ERK en PI3K/Akt overleven signaalwegen draagt bij aan ischemie weerstand in vivo en in vitro 7 8 (Kelleher-Anderson, Drew ea., In voorbereiding). Verdere karakterisatie van deze unieke zenuwcellen kunnen voorschot op vele fronten, met behulp van enkele of alle van deze methoden.
Protocol
Discussion
AGS volwassen neurale stamcellen zijn robuust en kan worden uitgebreid voor een groot aantal passages waardoor ze een uitstekende bron van neurale stamcellen voor onderzoek naar elementaire neurale stamcellen eigenschappen. De uitbreiding bedraagt ongeveer een verdubbeling elke vierentwintig uur, maar deze cellen moet voorafgaand aan het bereiken van samenloop worden gepasseerd, omdat contact tussen de cellen zal differentiatie gunst astrocyten. Contact-gemedieerde differentiatie zal daarom leiden tot de verhoudin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door US Army Medical Research en Materieel Command verlenen # 05178001 en door NS041069-06 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en beroerte. Wij danken Joel Vonnahme voor nuttige commentaar op het protocol.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| agsNSC | Lifeline | FC-0004 | ||
| agsNSC Expansion kit | Lifeline | LL-0008 | Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com) | |
| agsNSC differentiation kit | Lifeline | LL-0009 | Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com) | |
| NeuraLife maintenance media kit | Lifeline | LL-0012 | Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com) | |
| Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) | Hausser Scientific | 1490 | http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm | |
| Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates | BDBioscience | 356516 | www.bdbiosciences.com | |
| Large orifice pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-141 | Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com |
References
- Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
- Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37, 1261-1265 (2006).
- Dave, K. R. Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel. J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).
- Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).
- Christian, S. L. Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).
- Jin, K. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).
- Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).
- Sung, S. M. Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells. Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).
