Crescimento e Diferenciação de Adultos Hippocampal terra ártico Squirrel células-tronco neurais
Summary
Células-tronco neurais foram preparadas a partir do hipocampo de adultos não-hibernando yearling esquilos do Ártico (AGS). Essas células-tronco neurais pode ser expandida através de numerosas passagens, diferenciados e mantidos como um neurônio quase 50:50 para a cultura da glia.
Abstract
Esquilos do Ártico (Urocitellus parryii, AGS) são únicos em sua capacidade de hibernação com uma temperatura corporal central perto ou abaixo de zero 1. Estes animais também resistem lesão isquêmica no cérebro in vivo 2,3 e oxigênio privação glucose-in vitro 4,5. Estas qualidades únicas forneceu o ímpeto para isolar neurônios AGS para analisar características inerentes neuronal que poderia explicar a capacidade dos neurônios AGS para resistir a ferimentos e morte celular causada por isquemia e temperaturas extremamente frias. Identificar proteínas ou genes alvos que permitem as propriedades distintivas dessas células poderia auxiliar na descoberta de terapias eficazes para um número de indicações isquêmica e para o estudo da tolerância ao frio. Hipocampo adulto AGS contém células-tronco neurais que continuam a proliferar, permitindo a fácil expansão dessas células-tronco em cultura. Descrevemos aqui métodos pelos quais os pesquisadores podem utilizar estas células-tronco e neurônios diferenciados para qualquer número de finalidades. Ao acompanhar de perto estes passos a AGS células-tronco neurais pode ser expandida através de duas passagens ou mais e depois diferenciada para uma cultura rica em TUJ1 positivo neurônios (~ 50%) sem a utilização de produtos químicos tóxicos para minimizar o número de células em divisão. Isquemia induz a neurogênese 6 e neurogênese que procede via MEK / ERK e caminhos de sobrevivência PI3K/AKT contribui para a resistência a isquemia in vivo e in vitro 7 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., Em preparação). Caracterização adicional dessas células neurais única pode avançar em várias frentes, usando alguns ou todos esses métodos.
Protocol
Discussion
AGS adulto células-tronco neurais são robustos e podem ser expandidos para inúmeras passagens tornando-os uma excelente fonte de células-tronco neurais para estudo de propriedades básicas das células-tronco neurais. A taxa de expansão é de aproximadamente um dobrando a cada 24 horas, mas essas células devem ser várias passagens antes de chegar a confluência porque o contato entre as células irão favorecer a diferenciação de astrócitos. Contato mediado-diferenciação, portanto, fazer com que a proporçã…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos EUA de Investigação Médica do Exército e Comando de Material da bolsa # 05178001 e pelo NS041069-06 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame. Agradecemos a Joel Vonnahme para comentários úteis sobre o protocolo.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| agsNSC | Lifeline | FC-0004 | ||
| agsNSC Expansion kit | Lifeline | LL-0008 | Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com) | |
| agsNSC differentiation kit | Lifeline | LL-0009 | Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com) | |
| NeuraLife maintenance media kit | Lifeline | LL-0012 | Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com) | |
| Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) | Hausser Scientific | 1490 | http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm | |
| Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates | BDBioscience | 356516 | www.bdbiosciences.com | |
| Large orifice pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-141 | Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com |
References
- Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
- Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37, 1261-1265 (2006).
- Dave, K. R. Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel. J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).
- Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).
- Christian, S. L. Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).
- Jin, K. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).
- Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).
- Sung, S. M. Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells. Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).
