Summary

Croissance et différenciation des cellules adultes hippocampe Arctic écureuil souches neurales au sol

Published: January 07, 2011
doi:

Summary

Les cellules souches neurales ont été préparés à partir de l'hippocampe d'adultes non-hibernation yearlings spermophiles arctiques (AGS). Ces cellules souches neurales peuvent être complétés par de nombreux passages, différenciés et entretenu comme un neurone près 50:50 à la culture gliales.

Abstract

Les spermophiles arctiques (Urocitellus parryii, AGS) sont uniques dans leur capacité à hiberner avec une température corporelle de près ou en dessous de zéro 1. Ces animaux aussi résister à une lésion ischémique du cerveau in vivo 2,3 et de l'oxygène du glucose in vitro, la privation 4,5. Ces qualités uniques ont donné l'impulsion à isoler les neurones AGS afin d'examiner les caractéristiques inhérentes neuronales qui pourraient rendre compte de la capacité des neurones à résister à l'AGS blessures et la mort cellulaire provoquée par l'ischémie et les températures extrêmement froides. Identifier ou protéines cibles de gènes qui permettent pour les propriétés distinctives de ces cellules pourrait aider à la découverte de thérapies efficaces pour un certain nombre d'indications ischémiques et pour l'étude de la tolérance au froid. Adulte AGS hippocampe contient des cellules souches neurales qui continuent à proliférer, ce qui permet une extension facile de ces cellules souches en culture. Nous décrivons ici les méthodes par lesquelles les chercheurs peuvent utiliser ces cellules souches et les neurones différenciés pour n'importe quel nombre de buts. En suivant de près les étapes les cellules souches neurales AGS peut être étendu grâce à deux passages ou plus, puis différenciées pour une culture riche en TUJ1 neurones positifs (~ 50%) sans utiliser des produits chimiques toxiques afin de minimiser le nombre de cellules en division. L'ischémie induit neurogenèse 6 et neurogenèse qui procède par MEK / ERK et voies de survie PI3K/Akt de signalisation contribue à la résistance d'ischémie in vivo et in vitro 7 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., En préparation). Une caractérisation plus poussée de ces cellules uniques neurones peuvent avancer sur plusieurs fronts, en utilisant tout ou partie de ces méthodes.

Protocol

1. Cellule AGS souches neurales et les médias Préparation Adulte hippocampique écureuil au sol de l'Arctique (AGS) des cellules souches neurales isolées dans une manière décrite précédemment 9 peut maintenant être obtenu commercialement comme flacons cryopréservés. Les cellules sont expédiés dans des emballages nuit isolée contenant de la glace sèche pour s'assurer que les cellules restent dans un état cryopréservés. Pour maintenir l'intégrité, déballer les cellules…

Discussion

AGS cellules adultes souches neurales sont robustes et peuvent être étendues pour de nombreux passages qui en fait une excellente source de cellules souches neurales pour l'étude de la base neurale propriétés de cellules souches. Le taux d'expansion est d'environ un doublement tous les vingt-quatre heures, mais ces cellules doivent être repiquées avant d'atteindre la confluence, car le contact entre les cellules seront privilégier la différenciation d'astrocytes. Contactez-médiatisée de di…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'US Army Medical Research et le Commandement du matériel octroi # 05178001 et par NS041069-06 de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies. Nous remercions Joël Vonnahme des commentaires utiles sur le protocole.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
agsNSC   Lifeline FC-0004  
agsNSC Expansion kit   Lifeline LL-0008 Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com)
agsNSC differentiation kit   Lifeline LL-0009 Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com)
NeuraLife maintenance media kit   Lifeline LL-0012 Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com)
Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber)   Hausser Scientific 1490 http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm
Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates   BDBioscience 356516 www.bdbiosciences.com
Large orifice pipette tips   Fisher Scientific 02-707-141 Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com

References

  1. Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
  2. Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37, 1261-1265 (2006).
  3. Dave, K. R. Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel. J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).
  4. Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).
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  6. Jin, K. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).
  7. Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).
  8. Sung, S. M. Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells. Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).
  9. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).
  10. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).

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Cite This Article
Drew, K. L., McGee, R. C., Wells, M. S., Kelleher-Andersson, J. A. Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (47), e2199, doi:10.3791/2199 (2011).

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