Formanti colonia cellulare (CFC) Analisi per cellule emopoietiche

Umane ematopoietiche staminali / progenitrici sono solitamente ottenute da midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, o dal sangue periferico e sono utilizzati per lo studio ematopoiesi e leucemogenesi. Hanno la capacità di differenziarsi in linee linfoidi e mieloidi. La colonia di cellule che formano (CFC) test è usato per studiare la proliferazione e la differenziazione modello di progenitori emopoietici con la loro capacità di formare colonie in un mezzo semisolido. Il numero e la morfologia delle colonie formate da un numero fisso di celle di input fornire informazioni preliminari circa la capacità dei progenitori di differenziarsi e proliferare. Le cellule possono essere raccolte da singole colonie o da tutta la piastra per valutare ulteriormente il loro numero e gli stati di differenziazione in citometria a flusso e la valutazione morfologica di Giemsa vetrini colorati. Questo test è utile per valutare la differenziazione mieloide, ma non linfoidi. Il mieloide termine in questo contesto è usato nel suo senso più ampio fino a comprendere lignaggi granulocitica, monociti, eritroide e megacariociti.

Abbiamo usato questo test per valutare gli effetti di oncogeni sulla differenziazione delle primarie umane cellule CD34 + derivate dal sangue periferico. Per questo scopo sono le cellule trasdotte con entrambi costruire controllo retrovirali o un costrutto che esprime l'oncogene di interesse, in questo caso NUP98-HOXA9. Ci avvaliamo di un vettore retrovirale comunemente usato, MSCV-IRES-GFP, che esprime un mRNA bicistronic che produce il gene di interesse e di un marcatore GFP. Le cellule sono pre-attivate crescendo in presenza di citochine per due giorni prima della trasduzione retrovirale. Dopo altri due giorni, le cellule GFP + sono isolate dalla fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) e mescolato con un metilcellulosa mezzo contenente semisolido integrato con citochine e incubate fino colonie appaiono sulla superficie, in genere 14 giorni. Il numero e la morfologia delle colonie sono documentati. Le cellule vengono poi rimossi dalle piastre, lavato, contati, e sottoposti a citometria a flusso e l'esame morfologico. Citometria a flusso con anticorpi specifici marcatori di superficie della cellula espressi durante emopoiesi fornisce informazioni sulla genealogia e lo stadio di maturazione. Studi morfologici delle singole cellule al microscopio dopo la colorazione di Wright-Giemsa fornire ulteriori informazioni in materia di genealogia e di maturazione. Confronto di cellule trasdotte con controllo vettoriale vuoto a quelli trasdotte con un oncogene rivela gli effetti del oncogene sulla differenziazione ematopoietiche.