Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen

Humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen sind in der Regel aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder dem peripheren Blut gewonnen und genutzt werden, um die Blutbildung und Leukämogenese studieren. Sie haben die Fähigkeit, sich in lymphoiden und myeloischen Linien zu differenzieren. Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay wird verwendet, um die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen Muster durch ihre Fähigkeit, Kolonien in einem halbfesten Medium Form zu studieren. Die Anzahl und die Morphologie der Kolonien, die durch eine feste Anzahl von Input-Zellen gebildet vorläufige Angaben über die Fähigkeit der Vorläuferzellen zu differenzieren und zu vermehren. Die Zellen können aus einzelnen Kolonien oder die ganze Platte geerntet werden, um weiter zu prüfen ihre Zahl und Differenzierung Staaten mittels Durchflusszytometrie und morphologische Beurteilung der Giemsa-gefärbten Objektträgern. Dieser Test ist nützlich für die Beurteilung der myeloischen aber nicht lymphoide Differenzierung. Der Begriff myeloischer in diesem Zusammenhang ist im weiteren Sinne verwendet, um granulozytäre, Monozyten, erythroiden und Megakaryozyten Linien umfassen.

Wir haben diesen Test verwendet werden, um die Auswirkungen der Onkogene auf die Differenzierung von primären humanen CD34 +-Zellen aus dem peripheren Blut gewonnen zu beurteilen. Zu diesem Zweck Zellen sind entweder mit Kontrolle retroviralen Konstrukt oder ein Konstrukt Expression des Onkogens von Interesse transduziert, in diesem Fall NUP98-HOXA9. Wir beschäftigen eine häufig verwendete retrovirale Vektor, MSCV-IRES-GFP, dass eine bicistronische mRNA, die das Gen von Interesse und ein GFP-Marker produziert ausdrückt. Die Zellen werden durch die in Gegenwart von Zytokinen für zwei Tage vor der retroviralen Transduktion voraktiviert. Nach zwei weiteren Tagen werden GFP +-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert und mit einer Methylcellulose-haltigen halbfesten Medium mit Zytokinen ergänzt und inkubiert, bis Kolonien auf der Oberfläche, in der Regel 14 Tage angezeigt werden. Die Anzahl und Morphologie der Kolonien sind dokumentiert. Die Zellen werden dann von den Platten entfernt, gewaschen, gezählt und einer Durchflusszytometrie und morphologische Untersuchung. Durchflusszytometrie mit spezifischen Antikörpern an die Zelloberfläche Marker während der Hämatopoese ausgedrückt gibt Auskunft über Herkunft und Reifung der Bühne. Morphologische Untersuchungen von einzelnen Zellen unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa-Färbung liefern weitere Informationen in Bezug auf Herkunft und Reifung. Vergleich von Zellen transduziert mit Kontrolle leeren Vektor zu den transduzierten mit einem Onkogen zeigt die Auswirkungen des Onkogens auf hämatopoetischen Differenzierung.