تشكيل خلية مستعمرة (CFC) للخلايا المكونة للدم الفحص الإنسان
Summary
مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة هو فحص في المختبر الذي الأسلاف لدم شكل مستعمرات في وسط شبه صلبة. وتستخدم مجموعة من التشكل مستعمرة ، مورفولوجيا الخلايا ، والتدفق الخلوي لتقييم قدرة الأسلاف لتتكاثر والتفريق على طول الأنساب مختلفة للدم.
Abstract
وعادة ما يتم الحصول على الإنسان الجذعية المكونة للدم / السلف الخلايا من نخاع العظام ، دم الحبل السري ، أو الدم المحيطي وتستخدم لدراسة وleukemogenesis تكون الدم. لديهم القدرة على التمايز إلى الأنساب اللمفاوية والدم النخاعي. يستخدم مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة لدراسة انتشار والتفريق بين نمط الأسلاف للدم من خلال قدرتها على شكل مستعمرات في المتوسط نصف صلبة. عدد والتشكل في المستعمرات التي تشكلها على عدد ثابت من الخلايا الإدخال توفير المعلومات الأولية حول قدرة الأسلاف للتمييز وتتكاثر. يمكن حصاده من مستعمرات الخلايا الفردية أو من لوحة كاملة لمواصلة تقييم أعدادهم والدول تمايز باستخدام التدفق الخلوي والتقييم من مورفولوجية بالغيمزا الملطخة الشرائح. هذا الاختبار هو مفيد لتقييم التمايز النخاعي اللمفاوية ولكن لا. يستخدم مصطلح النخاعي في هذا السياق بمفهومها الواسع ليشمل الأنساب المحببات ، الوحيدات ، محمر ، والنواءات.
وقد استخدمنا هذا الاختبار لتقييم آثار المسرطنة على تمايز الخلايا الأولية + CD34 الإنسان المستمدة من الدم المحيطي. لهذا الغرض هي الخلايا transduced مع بناء التحكم إما فيروسات أو بناء التعبير عن الجين الورمي من الفائدة ، في هذه الحالة ، NUP98 HOXA9. نحن نوظف متجه استخداما فيروسات ، MSCV – IRES – GFP ، أن يعبر عن مرنا bicistronic الجينات التي تنتج من الاهتمام وعلامة GFP. هي خلايا ما قبل تفعيلها من خلال تزايد في وجود السيتوكينات لمدة يومين قبل تنبيغ فيروسات. بعد يومين آخرين ، يتم عزل الخلايا GFP + الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) ومختلطة مع methylcellulose المتوسطة التي تحتوي على نصف صلبة تستكمل مع السيتوكينات وحضنت المستعمرات حتى تظهر على السطح ، وعادة 14 يوما. يتم توثيق عدد والتشكل من المستعمرات. ثم تتم إزالة الخلايا من لوحات ، وغسلها ، عدها ، وتعرض للفحص التدفق الخلوي والمورفولوجية. التدفق الخلوي مع الاجسام المضادة المحددة لعلامات سطح الخلية التي أعرب عنها أثناء تكون الدم يوفر معلومات حول نسب ومرحلة النضج. الدراسات المورفولوجية الخلايا الفردية تحت المجهر بعد رايت تلوين غيمزا تقديم مزيد من المعلومات فيما يتعلق الانساب والنضج. transduced مقارنة مع خلايا مكافحة ناقلات الفارغة لتلك transduced مع الجين الورمي يكشف عن الآثار المترتبة على الجين الورمي على تمايز للدم.
Protocol
Discussion
وقد استخدم على نطاق واسع CFC مقايسة لتحديد أنماط انتشار والتفريق بين الأسلاف والمكونة للدم لدراسة آثار المسرطنة (4 ، 5). لها ميزة على الثقافات السائل من كونه مقايسة نسيلي ، ان هذه المستعمرات تمثل سلالة من سلف واحد ويمكن إزالتها بشكل فردي لمزيد من التحليل. الحد من مقايسة C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
