יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם
Summary
המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.
Abstract
האדם hematopoietic גזע / ובתאים מתקבלים בדרך כלל ממח העצם, דם טבורי, או דם היקפיים משמשים ללמוד hematopoiesis ו leukemogenesis. יש להם את היכולת להתמיין שושלות הלימפה ואת מיאלואידית. המושבה להרכיב (CFC) assay תא משמש כדי ללמוד את התרבות ואת דפוס הבידול של אבות hematopoietic על ידי היכולת שלהם ליצור מושבות בתווך מוצק למחצה. המספר את המורפולוגיה של המושבות הוקמה על ידי מספר קבוע של תאים קלט לספק מידע ראשוני על היכולת של אבות להבדיל מתרבים. תאים ניתן לקצור ממושבות הפרט או מהצלחת כולו להמשיך להעריך את מספרם ומדינות בידול באמצעות זרימת cytometry והערכה מורפולוגיים של Giemsa מוכתם שקופיות. Assay זה שימושי להערכת בידול מיאלואידית אך לא הלימפה. מיאלואידית המונח בהקשר זה משמש במובן הרחב שלה כדי להקיף שושלות granulocytic, monocytic, erythroid ו megakaryocytic.
השתמשנו זה assay כדי להעריך את ההשפעות של אונקוגנים על התמיינות של תאים אנושיים העיקרי CD34 + שמקורם דם היקפי. בשביל זה התאים למטרה הם transduced עם לבנות או לשלוט retroviral או לבנות ביטוי oncogene של עניין, במקרה זה NUP98-HOXA9. אנו מעסיקים וקטור retroviral נפוץ, MSCV-IRES-GFP, אשר מבטאת mRNA bicistronic שמייצר הגן של עניין סמן ה-GFP. תאים מופעלות מראש על ידי גידול בנוכחות ציטוקינים יומיים לפני התמרה retroviral. אחרי עוד יומיים, GFP + תאים מבודדים ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) ומעורבבים עם המדיום methylcellulose המכילים מוצק למחצה בתוספת ציטוקינים מודגרות עד מושבות להופיע על פני השטח, בדרך כלל על 14 ימים. מספר ומורפולוגיה של המושבות מתועדים. תאים יוסרו אז מן הלוחות, שטף, נספר, והוא נתון cytometry זרימה ובדיקה מורפולוגיים. Cytometry זרימה עם נוגדנים ספציפיים על פני התא סמנים הביע במהלך hematopoiesis מספק מידע על השושלת שלב ההבשלה. מחקרים מורפולוגי של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ לאחר מכתים רייט Giemsa לספק מידע נוסף לגבי השושלת והתבגרות. השוואה בין תאים transduced עם בקרת וקטור ריק לאלה transduced עם oncogene מגלה את ההשפעות של oncogene על בידול hematopoietic.
Protocol
Discussion
Assay CFC נמצא בשימוש נרחב על מנת לקבוע את תפוצת ואת דפוסי הבידול של אבות hematopoietic כדי לחקור את ההשפעות של אונקוגנים (4, 5). יש לו יתרון על פני תרבויות נוזלי להיות assay משובטים, כך המושבות לייצג את הצאצאים של אב יחיד ניתן להסיר באופן פרטני לצורך ניתוח נוסף. המגבלה של assay CFC היא שז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
