في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف
Summary
و<em> في الجسم الحي</emيستخدم> التصوير نظام لتوليد القياسات الكمية للعدوى الفئران مع الأوالي Trypanosomatid<em> الليشمانية</em>. هذا هو أسلوب غير الغازية وغير قاتلة للكشف عن الطفيليات معربا عن luciferase داخل أنسجة كثيرة طوال المزمنة<em> الليشمانية</em> النيابة. العدوى.
Abstract
أنواع متميزة<em> الليشمانيا ،</em> طفيلي الأسرة<em> المثقبيات</em> ، عادة ما تسبب مختلف مظاهر الأمراض التي تصيب البشر. الأشكال الأكثر شيوعا لمرض الليشمانيا الحشوية هي (VL) والليشمانيا الجلدية (CL). وتستخدم على نطاق واسع نماذج الماوس من هذا الداء ، ولكن القياس الكمي للأعباء المرض الطفيلي خلال الفئران يتطلب يتم التخلص الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى. ومن ثم يتم قياس الأحمال إما عن طريق الطفيلي المجهري ، مما يحد من مقايسة التخفيف ، أو التضخيم من الحمض النووي qPCR الطفيلي. و<em> في الجسم الحي</em> التصوير النظام (IVIS) يحتوي على مجموعة من البرامج المتكاملة التي تسمح للكشف عن إشارة bioluminescent المرتبطة الخلايا في الكائنات الحية. على حد سواء لتقليل استخدام الحيوان ومتابعة العدوى طوليا في الأفراد ، في النماذج الحية للتصوير<em> الليشمانية</em> النيابة. أنشئت VL تسبب أو CL. وكانت المهندسة للتعبير عن luciferase الطفيليات ، وعرضت هذه الفئران إما في الوريد أو intradermally. الكمية قياسات تلألؤ بيولوجي القيادة luciferase المعدلة وراثيا من<em> الليشمانية</emوأدلى> الطفيليات داخل الماوس باستخدام IVIS. ولا يمكن تصوير الفئران الفردية عدة مرات خلال دراسات طولية ، مما يسمح لنا لتقييم التباين بين الحيوانات في التجارب الأولية قائح الطفيلي ، وتقييم تكاثر الطفيليات في الأنسجة الماوس. تم الكشف عن الطفيليات مع حساسية عالية في مواقع الجلدي. على الرغم من أنه من المحتمل جدا أن إشارة (الفوتونات / ثانية / الطفيل) أقل في الأجهزة الحشوية أعمق من الجلد ، ولكن مقارنات كمية من الإشارات لم تكن قد فعلت في مقابل سطحية المواقع العميقة تم. فمن الممكن أن الأرقام لا يمكن الطفيلي بين المواقع الجسم يمكن مقارنته بشكل مباشر ، وإن كان يمكن مقارنة الأحمال الطفيلية في أنسجة نفسه بين الفئران. أمثلة من نوع واحد visceralizing (<em> L. الطفلية الشاغاسية</em>) ونوع واحد مما تسبب داء الليشمانيا الجلدي (<em> L. المكسيكية</emوترد>). ويمكن استخدام هذا الإجراء IVIS لرصد وتحليل نماذج حيوانية صغيرة من طائفة واسعة من<em> الليشمانية</em> الأنواع تسبب أشكال مختلفة من الليشمانيات الإنسان.
Protocol
Discussion
في الجسم الحي للنظام التصوير (IVIS) يوفر طريقة لتصوير الحيوان أو في الجسم الحي كله نماذج التصوير العدوى التجريبية لأشكال مختلفة من داء الليشمانيات. 18،16 وSPP الليشمانيا. ويمكن هندستها الطفيليات للتعبير عن يراعة luciferase على المستوى الذي يتم اكتشافه ف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المنحة مراجعة الاستحقاق من وزارة شؤون المحاربين القدامى ، من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AI045540 ، AI067874 ، AI076233 – 01 وAI080801 (الوزارة) ، وAI29646 (SMB). تم تنفيذ العمل في جزء من التمويل خلال التصوير المقطعي وJG بواسطة T32 NIH AI07511.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent | Caliper LifeSciences (Formerly Xenogen) | 122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper LifeSciences | Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
- Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
- LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
- Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
- Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
- Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
- da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
- Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
- Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
- Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
- McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
- Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
- Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
- Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
- Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
- Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
- Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
- Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).
