Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

1. Einführung In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie Drosophila Gehirn und Netzhaut für Live-Imaging-und Immunhistochemie mit einem Fokus auf Sehzellen vorzubereiten. Zunächst werden wir zeigen, wie man für die Gehirnentwicklung Dissektionen vorzubereiten. Als nächstes werden wir zeigen zwei grundlegende Dissektionen häufig für die Immunhistochemie verwendet, die die Grundlage für die Live-Vorbereitungen zu bilden. Diese beiden Präparate sind im erwachsenen Gehirn und Auge Dissektionen. Als nächstes werden wir die Sektionen für die Live-Darstellung von den Erwachsenen und sich entwickelnde Gehirn mit Schwerpunkt auf ihre Verwendung für die Live-Darstellung von Photorezeptoren verwendet. Schließlich werden wir beschreiben, wie wir Bild lebendem Gewebe und zeigen einige Beispiele von Live-Bildgebung mit resonant konfokalen Mikroskopie. 2. Dissection Vorbereitung Für eine gute Dissektionen, müssen Sie scharfe Zange. Mit einer Verschärfung blockieren oder sehr feinen Schleifpapier (> 1500), sanft passieren die Zange hin und her auf jeder Seite, bis die Enden mit einer feinen Spitze zu erfüllen. Wir verwenden eine Standard-Schleifstein. Wir werden nicht für die Schleiftechnik hier, aber beachten Sie, dass scharfe Zange wichtig für Live-Dissektionen sind. Wir schärfen Pinzette vor jeder Sektion. Für erwachsene Gehirn Dissektionen, statt die Fliegen auf einen CO 2-Pad, um sie zu betäuben und sortieren die gewünschten Genotyp. Für Puppenstadium Dissektionen, einfach in die Flasche gelangen und entfernen Sie vorsichtig eine Puppe mit einer Pinzette, wobei darauf zu vermeiden, bricht der Puppenhülle. Befeuchten Sie ein Kimwipe mit Wasser. Sie werden diese während der Präparation zu verwenden, um Schmutz von Ihrem Pinzette entfernen. Position einem Seziertisch Gericht auf der Bühne ein Stereoskop und füllen es mit HL3 Lösung 1. Alle Sektionen werden in HL3 durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Leben und gesund während der Dissektion Verfahren bleibt. Auch verwenden wir eine Dissektion Gericht, dass ein Bodenbelag der Sylgard zu Zange während der Präparation zu schützen. Jetzt bereiten Fixierlösung, wenn Sie Immunhistochemie durchführen möchten. Legen Sie 180μL der HL3 in eine 500μL Mikrozentrifugenröhrchen. Add 20 &mgr; l von 37% Formaldehyd zu einem 3,7% igen Formaldehyd-Lösung zu erhalten. Schließlich ist die richtige Handhaltung für gute Dissektionen wichtig. Mit einer guten Handhaltung, wird Ihr Pinzette werden stetig und in der Lage kontrollierte, subtile Bewegungen. Zuerst legen Sie die Zange an der Seite des Daumens. Dann bringen Sie den Zeigefinger senkrecht nach unten, so dass die Spitze des Fingers auf der Oberseite liegt. Nun ruhen die Seite der Pinzette auf der Seite des Mittelfingers und Umzug in die Dissektion Gericht. Machen Sie physischen Kontakt mit dem Gericht mit Daumen und Mittelfinger. Bei einer Rast mit Daumen und Mittelfinger auf den Teller, Pflanze Handgelenk auf dem Mikroskoptisch. Auf diese Weise haben Sie drei Punkte fest auf Oberflächen während der Präparation und es ist jetzt möglich, sehr subtile Manipulationen der Zange zu machen. Diese Technik kann sich ein wenig umständlich auf den ersten, aber mit etwas Übung werden Sie bald ein Meister des Gehirns Dissektionen werden. 3. Adulten Gehirn Auf der CO 2-Pad, fliegen orientieren eines Erwachsenen Bauchseite mit dem Kopf weg von deiner Hand. Besorgen Sie sich die Thorax unterhalb des Kopfes. Wenn man es richtig macht, wird der Beine und Rüssel zu verlängern. Beim Betrachten unter einem Stereoskop, greifen die erweiterten Rüssel mit einer Pinzette auf den Kopf zu entfernen. Entsorgen Sie den Körper und tauchen den Kopf. Neuausrichtung auf den untergetauchten Kopf. Die gesamte Präparation wird unter Lösung durchgeführt werden. Es ist sehr wichtig, auf den Kopf mit einer Pinzette zu allen Zeiten zu halten. Andernfalls wird der Kopf schweben und ist schwer zu holen. Wenn der Kopf bewegt sich außerhalb des Fokus während der Dissektion, verschieben Sie diese einfach zurück in die Brennebene ohne Anpassung des Mikroskops. Diese scheinbar einfache Aufgabe kann am Anfang schwierig, aber halten Sie Ihren Kopf in Schwerpunkt wird einfacher geworden im Laufe der Zeit. Beginnen Sie mit der Präparation, indem Sie zuerst reißt das Bindegewebe zwischen den Rüssel und das Auge. Reißen durch das Auge, während Sie fest mit mindestens einer Pinzette zu allen Zeiten. Seien Sie sicher, dass die Zehen der Zange nur knapp unter der Netzhaut oder die Nagelhaut, um eine Beschädigung des Gehirns darunter. Abwechselnd links und rechts, nutzen Sie Ihre Zange zu entreißen der Netzhaut, arbeiten gegen die Rückseite des Kopfes. Abreißen der Netzhaut wird die Chancen erhöhen, dass die Lamina an der optic lobe in diesem Dissektion bleibt. Weiter um die Rückseite des Kopfes, Reißen Nagelhaut auf dem Weg. Fegen Sie durch das andere Auge und beginnen Anfahren Nagelhaut. Solange Sie greifen Nagelhaut sind, wissen Sie, Sie sind nicht Zerkleinern des Gehirns! In diesem Sinne, weiterhin Kutikula und Netzhaut weg ziehen, bis das Gehirn wird aufgedeckt. Sobald das Gehirn sichtbar ist, können Sie damit beginnen, entfernen Luftröhre des Gehirns (Abb. 1A) befestigt. Weiter auf Luftröhre und Nagelhaut ziehen, bis das Gehirn isoliert. An dieser Stelle sollten Sie auf den Boden der Schüssel für t Neuausrichtunger verbleibenden Schritte. Entfernen Sie die restlichen Luftröhre, weil Ihr Gehirn kann nicht anders während der Nacht Antikörper wäscht schweben. Für die Bildgebung der Photorezeptor-Terminals, ist es wünschenswert, die Lamina zu halten, aber Sie müssen auf die Netzhaut, die den Zellkörper und stark autofluoreszierenden Pigment enthält zu entfernen. Um dies zu tun, genau auf den buschigen und pigmentierte Zellen bleibt zu ziehen, ohne Beschädigung der Lamina. Dies ist eine feinere Geschick und Übung braucht. Das erwachsene Gehirn am Leben gehalten für Stunden oder sogar Tage mit Bedingungen, die wir in Abschnitt 6 erörtert wird. Für die Immunhistochemie, ist das erwachsene Gehirn nun behoben werden in Formaldehyd. 2 Verwenden Sie ein P20 pipetteman eingestellt 5μL im erwachsenen Gehirn die Festsetzung Lösung, die Sie bereits erstellt haben, bewegen. Weiter Sezieren erwachsenen Gehirn für 20 Minuten, die Muß 4-10 Gehirn liefern. Lassen Sie den Kopf in Fix für weitere 40 Minuten, aber dieser Zeitraum kann für eine optimale primäre Antikörper-Färbung variieren. Entfernen Sie die Formaldehyd-Lösung und wäscht die Gehirne 3 mal für jeweils 5 Minuten in 400μL einer Lösung mit PBS und 0,4% TritonX-100, im Folgenden als PBS-Triton bezeichnet. Nach dem vollständigen Auswaschen der fix-Lösung, können Sie fügen primärer Antikörper-Lösung. 4. Adult Auge Beginnen Sie mit dieser Präparation wie bei den erwachsenen Gehirn beschrieben. Nach Eintauchen des Kopfes und Neuausrichtung des Mikroskops, durch Abreißen des Bindegewebes zwischen den Rüssel und das Auge zu starten. Oberhalb des Rüssels, trennen Sie die Nagelhaut aus dem Auge. Nun, trennen Sie die Nagelhaut von der Unterseite des Auges, arbeiten gegen die Rückseite des Kopfes. Mit einer Pinzette greifen die Mitte der Rückseite des Kopfes. Bei den anderen, greifen das Auge und ziehen. Lassen Sie den Blick auf den Boden der Schale absetzen (Abb. 1B). Die Lamina wird wahrscheinlich immer noch für das Auge angebracht werden und kann für die Live-Darstellung der Klemmen vollständig intakt Sehzellen zu diesem Zeitpunkt verwendet werden. Um weiterhin mit Live-Darstellung von Photorezeptor Zellkörper, Abschnitt 4.5 zu gehen. Die nächsten drei Abschnitte erläutern festen Auge Immunhistochemie. Für die Immunhistochemie, bewegen Sie den Blick auf Fixierlösung mit einem P20 pipetteman eingestellt 5μL. Weiter Sezieren erwachsenen Augen für insgesamt 10 Minuten. Lassen Sie die Augen in fix für weitere 30 Minuten. Entfernen Sie das Update-Lösung und Verhalten wäscht als im erwachsenen Gehirn Dissektion beschrieben. Wenn Sie schließlich wollen Image der ommatidial Struktur des Auges der Lamina muss jetzt entfernt werden. Liefert die feste Augen zu Ihrem Sezieren Schüssel und entfernen Sie alle Luftröhre oder Fettzellen, die möglicherweise noch angebracht. Als nächstes, während die Außenseite des Auges mit einer Pinzette entfernen der Lamina mit den anderen. Es sollte kommen, in einem Stück, Freilegung der cellbodies darunter (Abb. 1B). Achten Sie darauf, die Lamina nur zuschlagen! Andernfalls riskieren Sie, Ablösen der Photorezeptoren der Netzhaut. Mit einem P20 pipetteman bewegen sich die Augen zu 400uL PBS-Triton in einem 500 ul Röhre. Schütteln Sie sie bei 4 Grad über Nacht auf die autofluoreszierenden rote Pigment von den Photorezeptoren zu entfernen. Am folgenden Tag können Sie verwerfen die Waschlösung und fügen primärer Antikörper-Lösung. Für die Live-Darstellung von erwachsenen Augen verwenden wir nur pharate erwachsenen Fliegen, also spät Puppen kurz vor Schlüpfen. In diesem Stadium der Photorezeptor Zellkörper getrennt von Terminals in der Lamina während der Präparation. Pharate erwachsenen Puppen haben klar definierte Flügel, Augen und Nagelhaut sichtbar durch die Puppenhülle. Wählen Sie eine Puppe, und entfernen Sie den vorderen Teil der Puppenhülle der Kopfbereich aussetzen. Entfernen Sie vorsichtig die dünne innere Membran, die zusätzlich umschließt den Entwicklungsländern zu fliegen. Besorgen Sie sich die Unterseite des Kopfes mit einer Pinzette und ziehen. Entsorgen Sie den Rest der Puppe und dabei den Kopf unter Wasser. Gehen Sie wie im Auge dissection für die Immunhistochemie nachgewiesen. Am pharate erwachsenen Stadium, jedoch wird der Photorezeptor Zellkörper leichter lösen aus der Lamina, so dass Sie Bild der Zellkörper in die Netzhaut eingebettet. Auch bleibt die Lamina an der optic lobe, so dass Sie Bild der distalen Lamina. Wenn Sie zum Bild der proximalen Lamina, wo die Photorezeptor-Terminal Patronen sehen kann wollen, führen Sie dann das Auge Dissektion auf einen Erwachsenen fliegen, wo die Lamina stärker auf das Auge verbunden ist. 5. Entwickeln Auge Disc-Hirn-Komplexe Die Entwicklung von Auge Scheibe bei 20% Puppenstadium Entwicklung (P +20%) hat sich zu einem Favoriten für Live-Aufnahmen in unserem Labor, weil diese eine Schicht von relativ großen entwickelnden Zellen leichter zu beobachten ist mit der konfokalen Mikroskopie. 3 So wählen Sie einen 20% Puppe, für die Malpighischen Gefäße, einen grünen Punkt der erscheint unter dem Puppenstadium Fall aussehen, und vermeiden Sie Puppen, die eine "dunkle Stelle" 4 haben. Nach Auswahl einer P +20% Puppe, tauchen Sie es in HL3 in Ihrem Sezieren Teller und entfernen Sie vorsichtig eine vordere Teil des Puppenstadium Sack, wobei darauf geachtetnicht zu durchdringen die dünne innere Membran. Fassen Sie die innere Membran mit einer Pinzette und auseinanderziehen. Vorsichtig durch die freigesetzten Inhaltsstoffe Suche auf das sich entwickelnde Gehirn und Auge-Discs, die ganz prominenten (Abb. 1C) zu finden. Das Auge Disc-Hirn-Komplex ist einfach in diesem Stadium der Metamorphose getrennt. Isolieren des Gehirns auf den Boden des Sezieren Gericht. Sorgfältig trennen die zentrale Gehirn von der Optik Lappen. Die Optik lobe / Auge Festplatte wird in Live-Bildgebung verwendet werden. 6. Live-Imaging: An dem Mikroskop Wenn Sie auf die Grafik für eine kurze Zeit in nur ein oder zwei Lösungen wünschen, können Sie Ihr Bild Gewebes auf einem Objektträger aus Glas. In diesem Fall bereiten die Folie, indem Sie zunächst die Beschichtung der Oberfläche mit Sylgard mit den Anweisungen des Herstellers. Legen Sie 20 &mgr; l HL3 in der Mitte des Schlittens. Transportieren Sie Ihren seziert Gewebe in 20 weiteren ul HL3 auf die Folie. Das Gewebe darf NIEMALS an der Luft ausgesetzt werden. Darüber hinaus muss jede Belastung oder Stress aus Pipetten-Handling oder der Lösung Oberflächenspannung vermieden werden. Für Live-Bildgebung, muss das Gewebe fest mit minimalem Handling und Kontakt gesichert werden. Wir sicher zu positionieren das Gehirn mit dem Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber GluShield durch eine Mikroelektrode aufgetragen, eine Technik, die routinemäßig für embryonale Präparate für die Elektrophysiologie 5 verwendet. Besorgen Sie sich eine Glaselektrode, wie sie für elektrophysiologischen Ableitungen gezogen. Brechen Sie die Spitze und füllen Sie das Ende mit GluShield mit Unterdruck durch den Mund erzeugt. Brechen Sie nur genug von der Elektrode, Leim eindringen können. Verwenden Sie nun positive Druck, eine kleine Menge Leim auf die Sylgard gelten unter einem Rückgang von HL3. Jetzt schnell die Gewebe auf den Leim, die Aufrechterhaltung der gewünschten Orientierung für die Live-Bildgebung. Ein Wasser-Immersions-Objektiv kann nun für die Bildgebung verwendet werden. Wenn Sie eine durchlässige Membran Farbstoff hinzufügen möchten, können Sie es in das Bad während Bildgebung hinzuzufügen. Wir verwenden ein Resonant konfokalen Mikroskop, die eine schnelle Bildgebung ermöglicht mit reduzierter Ausbleichen. 6 Für die Bildgebung über lange Zeiträume oder zum Austausch von Lösungen ganz oder mehrfach verwenden wir eine Perfusionskammer (Harvard IC30 konfokale Bildgebung Kammer), die zu einer Schlauchpumpe verbindet die langsam perfundiert Kultur-Lösung über die Live-Gewebe (Abb. 2A). Die Bewegung der Flüssigkeit konstant Austausch und minimal GluShield Kontakt reduzieren die Abflachung des Gewebes, das über längere Zeiträume Zeit 7 beobachtet wurde. Beachten Sie, dass für die Abbildung von Entwicklungsprozessen Zeiträume, das Auge Disc-Hirn-Komplex intakt bleiben und sollten minimal Kontakt mit dem Kleber haben muss. Verwenden Sie ein Deckglas mit einem Tropfen Sylgard, dass rasiert um es dünn und flach beschichtet ist. Dispense 20 &mgr; l HL3 auf die Mitte des Deckglases und kleben Sie die lebendes Gewebe, die Sylgard. Generieren Sie eine Dichtung, die damit entstehende Blasen durch die Kammer, ohne dass die lebendes Gewebe in die Luft (Abb. 2B) pass wird. Die Dichtung sollte dick genug sein, um zu vermeiden Zerkleinerung des Gewebes, aber dünn genug, um das Gewebe in der Nähe des konfokalen Mikroskop-Objektiv zu bringen, wir nutzen 250μm in unserer Einrichtung. Montieren Sie die Perfusionskammer, wobei darauf geachtet, um das Gewebe vollständig zu jeder Zeit unter Wasser zu halten. Begin Perfusion zunächst mit einer Rate nahe 100 &mgr; pro Minute mit einer Schlauchpumpe. Diese Geschwindigkeit ist relativ schnell in Abhängigkeit von der Dichtungsdicke, dass die Kammer Höhe definiert. Für die Bildgebung in der Größenordnung von Stunden, müssen Sie 20-hydroxyecdysone und Antibiotika, aber nicht antimykotische hinzufügen, und führen Sie Perfusion bei viel niedrigeren Geschwindigkeiten um 10 &mgr; l pro Minute. Schließlich haben wir Blase Sauerstoff in das Kulturmedium, dass die Perfusionskammer liefert. 7. Repräsentative Ergebnisse: Am Ende unserer Video-Protokoll zeigen wir ein Beispiel für Live-Bildgebung bei der Entwicklung von Sehzellen mit der Vorbereitung in Abschnitt 5 vorgestellt. Diese Vorbereitung nutzt Drosophila Transgenese, Zell-spezifisch ausdrücken fluoreszierenden Reporter. Die Membran-tagged myrRFP und der endosomalen Marker 2xFYVE-GFP 9: In dem gezeigten Beispiel sind zwei fluoreszierenden Reporter unter Kontrolle der Photorezeptor-spezifischen GMR-Gal4-Treiber 8 geäußert. Zwei-Kanal-3D-Datensätzen mit einem Begrenzungsrahmen 70x70x17.5μm und eine Voxelgröße von 137x137x700nm (512x512x26) wurden jeweils 1 min erreicht. Der Film zeigt einen ausgewählten Ebene im Laufe der Zeit in diesem 4D Datenmenge, die Dynamik der intrazellulären endosomalen Menschenhandel und Vesikelfusion Ereignisse enthüllt. Repräsentative Bilder für feste Gewebe Vorbereitungen des Auges und der Lamina sind in Abb.. 3.