Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

1. Introducción En este video, vamos a demostrar cómo preparar cerebro de Drosophila y retinas de imágenes en vivo e inmunohistoquímica con un enfoque en las células fotorreceptoras. En primer lugar, vamos a mostrar cómo prepararse para la disección del cerebro. A continuación, vamos a demostrar dos disecciones básicos comúnmente utilizados para inmunohistoquímica que forman la base para la preparación en vivo. Estas dos preparaciones son el cerebro adulto y disecciones del ojo. A continuación, vamos a demostrar la disección utilizado para imágenes en vivo del cerebro adulto y en desarrollo, con énfasis en su uso de imágenes en vivo de los fotorreceptores. Por último, se describe la forma en que el tejido de imágenes en vivo y mostrar algunos ejemplos de imágenes en vivo utilizando microscopía confocal de resonancia. 2. Disección de la preparación Para las disecciones bueno, usted necesita pinzas afiladas. El uso de un bloque de afilar o papel de lija muy fino (> 1500), pasar suavemente la pinza de ida y vuelta en cada lado hasta que los extremos se encuentran en una punta fina. Utilizamos una piedra nivel de nitidez estándar. No vamos a cubrir la técnica de enfoque aquí, pero tenga en cuenta que las pinzas afiladas son esenciales para las disecciones en vivo. Afilamos fórceps antes de cada disección. Para la disección del cerebro adulto, el lugar de las moscas en una plataforma de CO 2 para anestesiar y resolver el genotipo deseado. Para las disecciones de pupa, simplemente la mano en el frasco y retirar con cuidado una pupa con sus pinzas, teniendo cuidado de no romper la envoltura pupal. Humedezca un Kimwipe con agua. Van a utilizar este durante la disección para eliminar los restos de su fórceps. Coloque un plato de disección en el escenario de un estereoscopio y llenarlo con una solución HL3. Todas las disecciones se llevará a cabo en HL3 para asegurarse de que el tejido se mantiene vivo y saludable durante el proceso de disección. Además, usamos un plato de disección que tiene una cubierta inferior de Sylgard para proteger fórceps durante la disección. Ahora, preparar la fijación de solución si va a realizar la inmunohistoquímica. Lugar 180μL de HL3 en un tubo de microcentrífuga de 500μL. Añadir 20μL de formaldehído al 37% para obtener una solución de formaldehído al 3,7%. Por último, la posición adecuada de las manos es importante para las disecciones buena. Con la posición de la mano buena, la pinza se firme y capaz de movimientos controlados y sutil. Primero, coloque la pinza en el lado del dedo pulgar. A continuación, llevar el dedo índice hacia abajo de tal manera que la punta del dedo se apoya en la parte superior. Ahora descansa al lado de la pinza en el lado del dedo medio y pasar al plato de la disección. Tener contacto físico con el plato de su dedo pulgar y el dedo medio. Mientras descansa el pulgar y el dedo medio en el plato, planta de la muñeca en la platina del microscopio. De esta manera, usted tiene tres puntos firmemente plantados en las superficies durante la disección y ahora es posible hacer manipulaciones muy sutiles de las pinzas. Esta técnica se puede sentir un poco incómodo al principio, pero con la práctica, que pronto será un maestro de la disección del cerebro. 3. Cerebro adulto En la plataforma de CO 2, orientar una mosca adulta lado ventral hacia arriba con la cabeza lejos de su mano. Coge el tórax, inmediatamente por debajo de la cabeza. Si se realiza correctamente, las piernas y la trompa se extiende. Al tiempo que visualiza en un estereoscopio, agarrar la trompa extendida con pinzas para quitar de la cabeza. Deseche el cuerpo y sumergir la cabeza. Reorientar a la cabeza sumergida. La disección completa se llevará a cabo en solución. Es muy importante mantener a la cabeza con unas pinzas en todo momento. De lo contrario, el jefe va a flotar y es difícil de recuperar. Si la cabeza se mueve fuera de foco durante la disección, sólo tiene que mover de nuevo en el plano focal, sin ajustar el microscopio. Esta tarea aparentemente simple puede ser difícil al principio, pero manteniendo la cabeza en el enfoque será más fácil el paso del tiempo. Comenzar la disección, en primer lugar romper el tejido conjuntivo entre la trompa y el ojo. Lágrima en el ojo mientras se mantiene firme con al menos una pinza en todo momento. Asegúrese de que la punta de la pinza es justo debajo de la retina o cutícula, para evitar daños en la parte de abajo del cerebro. Alternando izquierda y derecha, utilice el fórceps para separarse de la retina, trabajando hacia la parte posterior de la cabeza. Arrancando la retina aumenta las probabilidades de que la lámina se mantiene unido al lóbulo óptico a lo largo de esta disección. Continuar por la parte trasera de la cabeza, lagrimeo cutícula en el camino. Lágrima en el ojo y otros que comienzan a separarse cutícula. Siempre y cuando se están apoderando de la cutícula, usted sabe que no están aplastando el cerebro! Con esto en mente, seguir para sacar la cutícula y la retina se desprenda hasta que el cerebro se pone de manifiesto. Una vez que el cerebro es visible, se puede empezar a eliminar la tráquea conectado al cerebro (Fig. 1A). Continuar a tirar de la tráquea y la cutícula hasta que el cerebro está aislado. En este punto, se debe reorientar hacia el fondo de su plato para tque pasos restantes. Retire el resto de la tráquea, porque el cerebro de lo contrario pueden flotar durante el lavado de anticuerpos durante la noche. Para obtener imágenes de las terminales de los fotorreceptores, es conveniente mantener la lámina, pero tiene que quitar de la retina, que contiene los cuerpos celulares y los pigmentos fuertemente autofluorescentes. Para ello, tire con cuidado los restos celulares espesas y pigmentadas sin dañar la lámina. Esta es una habilidad más fino y requiere práctica. El cerebro adulto puede ser mantenido con vida durante horas o incluso días con las condiciones que se discutirán en la sección 6. Por inmunohistoquímica, el cerebro adulto está listo para ser fijado en formol. 2 Utilice un pipetteman P20 establecido en 5μL para mover el cerebro de un adulto a la solución de fijación que ya ha preparado. Continúe la disección de los cerebros de adultos durante 20 minutos, que debe producir 4.10 cerebros. Deja el cerebro de fijar por un período adicional de 40 minutos, sin embargo, este plazo puede variar para la tinción óptima anticuerpo primario. Retire la solución de formaldehído y lavar el cerebro de 3 veces durante 5 minutos cada uno en 400μL de una solución de PBS y 0,4% TritonX-100, en lo sucesivo, PBS-Tritón. Después de terminar de lavar la solución de arreglo, es posible agregar la solución de anticuerpo primario. 4. Ojo adulto Comience esta disección se ha descrito para el cerebro adulto. Después de sumergir la cabeza y la reorientación del microscopio, empezar por romper el tejido conjuntivo entre la trompa y el ojo. Por encima de la trompa, aparte de la cutícula de los ojos. Ahora, separado de la cutícula de la parte inferior del ojo, trabajando hacia la parte posterior de la cabeza. Con una pinza, tomar el centro de la parte posterior de la cabeza. Con el otro, llaman la atención y tirar. Permitir que el ojo se depositan en el fondo del plato (Fig. 1B). La lámina es probable que permanece unido a la vista y se puede utilizar para obtener imágenes en directo de los terminales de las células fotorreceptoras completamente intacto en este momento. Para continuar con imágenes en vivo de los órganos de las células fotorreceptoras, vaya a la sección 4.5. Las tres secciones siguientes explican inmunohistoquímica ojos fijos. Por inmunohistoquímica, mover el ojo a la fijación de solución con un conjunto de pipetteman P20 5μL. Continúe la disección de los ojos de un adulto para un total de 10 minutos. Dejar los ojos en la solución durante 30 minutos. Eliminar la solución de fijar y realizar lavados como se describe en la disección del cerebro adulto. Si en última instancia, desean a la imagen de la estructura ommatidial del ojo de la lámina debe ser retirado ahora. Volver la mirada fija en su plato de disección y eliminar las células tráquea o grasa que aún se puede unir. A continuación, mientras mantiene la parte exterior del ojo con una pinza, retire la lámina con la otra. Se debe salir en una sola pieza, dejando al descubierto la cellbodies debajo (Fig. 1B). Tenga cuidado al agarrar la lámina única! De lo contrario, corre el riesgo de desprendimiento de los fotorreceptores de la retina. El uso de un pipetteman P20, mover los ojos a 400uL PBS-Tritón en un tubo de 500 ul. Con cuidado, la roca a 4 grados durante la noche para eliminar el pigmento rojo autofluorescentes de los fotorreceptores. Al día siguiente, se puede descartar la solución de lavado y agregar la solución de anticuerpo primario. Para imágenes en vivo de los ojos de un adulto y sólo la usamos moscas pharate adultos, es decir, las pupas de etapa tardía, poco antes de la eclosión. En esta etapa, los cuerpos de las células fotorreceptoras por separado desde las terminales de la lámina durante la disección. Pharate adultos pupas tienen bien definidas las alas, ojos, y la cutícula visible a través de la envoltura pupal. Seleccione una pupa y eliminar la parte anterior de la cápsula de la pupa para exponer la región de la cabeza. Retire con cuidado la membrana delgada interior que encierra, además, la mosca en desarrollo. Coge la base de la cabeza con su pinza y tire. Deseche el resto de la pupa, mientras que mantener la cabeza sumergida. Proceder como se demuestra en la disección de los ojos para inmunohistoquímica. En la etapa adulta pharate, sin embargo, los cuerpos de las células fotorreceptoras se desprenden más fácilmente de la lámina, lo que le permite a la imagen de los cuerpos celulares ubicado en la retina. Además, la lámina permanece unido al lóbulo óptico, lo que le permite a la imagen de la lámina distal. Si desea la imagen de la lámina proximal, donde los cartuchos de la terminal de fotorreceptores se puede observar, a continuación, realizar la disección del ojo de una mosca adulta, donde es más fuerte la lámina adjunta a la vista. 5. El desarrollo de los ojos del cerebro disco complejos El disco del ojo en desarrollo en un 20% el desarrollo pupal (P 20%) se ha convertido en uno de los favoritos para obtener imágenes en vivo en nuestro laboratorio, porque esta sola capa de células en desarrollo relativamente grande es fácilmente observable mediante microscopía confocal. 3 Para seleccionar un 20% de pupa, busque los túbulos de Malpighi, un punto verde aparece debajo de la del caso de pupa, pupa y evitar que tengan un "cuerpo negro" 4. Después de seleccionar un sumergirse P +20% pupa, en HL3 en su plato de disección y retire con cuidado una porción anterior de la bolsa de pupa, teniendo cuidado deno para penetrar en la membrana interna delgada. Sujete la membrana interna con sus pinzas y se separan. Con cuidado, buscar a través de los contenidos lanzado para encontrar el desarrollo del cerebro y los discos de los ojos que son muy prominentes (Fig. 1C). El ojo de disco complejo del cerebro que se separa fácilmente en esta etapa de la metamorfosis. Aislar el cerebro en la parte inferior de la placa de disección. Separar cuidadosamente el cerebro central del lóbulo óptico. La óptica del lóbulo / ojo disco se va utilizar en las imágenes en vivo. 6. Vivir de imagen: En el microscopio Si desea la imagen de un corto período de tiempo en sólo una o dos soluciones, es posible que la imagen de su tejido en un portaobjetos de vidrio. En este caso, preparar la diapositiva por primera capa de la superficie con Sylgard con las instrucciones del fabricante. Lugar 20μL HL3 en el centro de la diapositiva. El transporte de sus tejidos disecados en 20 l adicionales de HL3 a la diapositiva. El tejido NUNCA debe ser expuesto al aire. Además, el estrés o la tensión de la manipulación o la pipeta de la tensión superficial solución debe ser evitado. Para imágenes en vivo, el tejido debe estar firmemente asegurado con una manipulación mínima y el contacto. De manera segura a la posición del cerebro utilizando el GluShield agua polimerización pegamento quirúrgico aplicado a través de un microelectrodo, una técnica habitual utilizada para la preparación de embriones para la electrofisiología 5. Obtener un electrodo de vidrio como los que sacó de los registros electrofisiológicos. Romper la punta y rellene el final con GluShield presión de aire negativa generada por la boca. Romper sólo lo suficiente del electrodo que el pegamento puede entrar. Ahora el uso de presión positiva para aplicar una pequeña cantidad de pegamento a la Sylgard en una gota de HL3. Ahora, rápidamente el tejido de la cola, el mantenimiento de la orientación deseada para la imagen en vivo. Una lente de inmersión en agua se puede utilizar ahora para obtener imágenes. Si quiere añadir un colorante membrana permeable, se puede añadir al baño, mientras que la imagen. Nosotros usamos un microscopio de barrido confocal de resonancia que permite imágenes rápidas con la reducción de photobleaching. 6 Para imágenes durante largos períodos de tiempo o de soluciones de intercambio total o varias veces, se utiliza una cámara de perfusión (Harvard IC30 microscopía confocal de la cámara) que se conecta a una bomba peristáltica que poco a poco perfunde solución de cultivo sobre el tejido vivo (Fig. 2A). Movimiento de cambio constante contacto con líquidos y GluShield mínima reducir el aplastamiento de los tejidos que se ha observado durante períodos más largos de tiempo 7. Tenga en cuenta que para la imagen de los períodos de tiempo de desarrollo, el ojo de disco complejo del cerebro que tiene que estar intacto y tienen un contacto mínimo con el pegamento. Use una hoja de cubierta revestida con una gota de Sylgard que se afeita para que sea delgada y plana. Dispense 20μL HL3 en el centro del cubreobjetos y la cola del tejido vivo de la Sylgard. Generar una junta que permitir que las burbujas para pasar a través de la cámara, sin exponer el tejido vivo al aire (Fig. 2B). La junta debe ser lo suficientemente gruesa como para evitar el aplastamiento de los tejidos, pero lo suficientemente delgada como para que el tejido cerca de la lente de un microscopio confocal, que utilizamos en nuestra configuración de 250 micras. Montar la cámara de perfusión, teniendo cuidado de mantener el tejido sumergido por completo en todo momento. Comenzar la perfusión inicialmente a una tasa cercana a 100μL por minuto, utilizando una bomba peristáltica. Esta velocidad es más rápida en función del espesor de la junta que define la altura de la cámara. Para la imagen en la escala de horas, puede que tenga que añadir 20 hidroxiecdisona y antibióticos, antimicóticos, pero no, y realizar la perfusión a una velocidad mucho más baja alrededor de 10μl por minuto. Finalmente, la burbuja de oxígeno en el medio de cultivo que abastece a la cámara de perfusión. 7. Los resultados representativos: Al final de nuestro protocolo de vídeo se muestra un ejemplo de imagen en vivo de las células fotorreceptoras de desarrollo a través de la preparación en la Sección 5. Esta preparación se aprovecha de Drosophila transgénesis de células expresan específicamente a los periodistas fluorescentes. En el ejemplo mostrado, dos reporteros fluorescentes se expresan bajo el control de los fotorreceptores específicos de GMR-Gal4 conductor 8: la membrana de la etiqueta myrRFP y el marcador endosomal 2xFYVE-GFP 9. De dos canales conjuntos de datos 3D con una caja de delimitación de 70x70x17.5μm y un tamaño de voxel de 137x137x700nm (512x512x26) se obtuvieron cada 1 min. La película muestra un plano seleccionado con el tiempo en esta base de datos 4D que revela la dinámica del tráfico intracelular de vesículas endosomal y eventos de fusión. Imágenes representativas de preparaciones de tejidos fijos del ojo y la lámina se muestra en la figura. 3.