Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

W. Ryan Williamson; P. Robin Hiesinger

doi:10.3791/1936

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biology

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

Published: March 15, 2010

doi:

10.3791/1936

W. Ryan Williamson¹, P. Robin Hiesinger¹

¹Department of Physiology and Green Center for Systems Biology,University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

هذا البروتوكول يصف ثلاثة ذبابة الفاكهة التحضير : 1) تشريح الدماغ الكبار ، 2) تشريح الشبكية الكبار و 3) تطوير تشريح العين والدماغ المجمعات القرص. ويتم التشديد على تقنيات إعداد والظروف الخاصة للتصوير الحي ، رغم أنه يمكن استخدام كافة الاستعدادات لالمناعية الأنسجة الثابتة.

Abstract

و ذبابة الفاكهة</emوتستخدم على نطاق واسع> الدماغ والجهاز البصري نظم نموذجية لدراسة تطوير الخلايا العصبية ، وظيفة وانحطاط. نحن هنا المعرض الثلاثة التحضيرية للدماغ والنظام البصري والتي تغطي مجموعة من مجمع تطوير قرص الدماغ العين في العين الشرانق النامية على الفرد وتشريح الدماغ من الذباب الكبار. هي الأمثل لكافة البروتوكولات ثقافة حية من الاستعدادات. ومع ذلك ، فإننا نقدم أيضا شروط المناعية الأنسجة الثابتة حيثما ينطبق ذلك. أخيرا ، وتبين لنا ظروف التصوير الحي لهذه الاستعدادات باستخدام الرنين التقليدية والتصوير مبائر 4D يعيش في غرفة الارواء. معا ، هذه البروتوكولات توفير أساس لتصوير يعيشون على جداول زمنية مختلفة بدءا من الخلايا الوظيفية المقايسات على مقياس من دقيقة لعمليات التنمية أو التنكسية على مقياس من عدة ساعات.

Protocol

1. مقدمة في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية إعداد العقول ذبابة الفاكهة والشبكية للتصوير العيش والمناعية ، مع التركيز على خلايا مستقبلة للضوء. أولا ، سوف نعرض كيفية الاستعداد لتشريح الدماغ. المقبل ، وسوف نظهر two تشريح الأساسية المستخدمة عادة لالمناعية التي تشكل أساسا للتحضير حية. هذه الاستعدادات هما الدماغ الكبار وتشريح العين. المقبل ، سوف نقوم شرح تشريح المستخدمة في التصوير تعيش في الدماغ الكبار والنامية مع التركيز على استخدامها لتصوير حي لمبصرات. وأخيرا ، فإننا سوف تصف كيف يمكننا الأنسجة الحية وتظهر الصور بعض الأمثلة الحية من التصوير المجهري باستخدام مبائر الرنانة. 2. تشريح إعداد لتشريح جيدة ، تحتاج ملقط حادة. باستخدام كتلة شحذ أو الرمل ورقة جيدة جدا (> 1500) ، وتمرير ملقط بلطف ذهابا وإيابا على كل جانب حتى ينتهي عند نقطة تلبية غرامة. نستخدم الحجر شحذ القياسية. فإننا لن تغطي تقنية شحذ هنا ، ولكن نلاحظ أن ملقط حادة ضرورية لتشريح الأحياء. نحن قبل كل شحذ ملقط تشريح. لتشريح الدماغ الكبار ، ووضع الذباب على وسادة CO 2 إلى تخدير لهم وفرز الوراثي المنشود. لتشريح العذراء ، والوصول ببساطة إلى القارورة وإزالة بعناية خادرة بالملقط الخاص ، والحرص لتجنب كسر حالة العذراء. بلل a Kimwipe بالماء. سوف تستخدم هذه أثناء تشريح لإزالة الأنقاض من الملقط الخاص. موقف طبق تشريح على مرحلة من مراحل المجسام وملء مع HL3 حل 1. وسيجري تشريح في جميع HL3 لضمان أن تبقى على قيد الحياة في نسيج وصحية أثناء إجراء تشريح. أيضا ، ونحن نستخدم طبق التشريح الذي يحتوي على تغطية الجزء السفلي من Sylgard لحماية ملقط أثناء تشريح. الآن ، يعد تحديد الحل إذا كنت تخطط لتنفيذ المناعية. 180μL مكان HL3 في أنبوب microcentrifuge 500μL. إضافة 20μL من الفورمالديهايد بنسبة 37 ٪ للحصول على حل الفورمالديهايد 3.7 ٪. أخيرا ، الموقف السليم مهم لجهة التشريح جيدة. مع موقف الجانب جيدة ، وسوف يكون لديك ملقط ثابتة وقادرة على الحركة ، التي تسيطر عليها خفية. أولا ، وضع ملقط على جانب الإبهام. ثم جعل السبابة أسفل مستقيم بحيث طرف الاصبع تقع على القمة. الباقي الآن على جانب ملقط على جانب إصبعك الوسطى والانتقال إلى الطبق تشريح. جعل اتصال جسدي مع الطبق بواسطة الإبهام والإصبع الوسطى. بينما يستريح إبهامك والإصبع الأوسط على طبق ، النبات معصمك على المسرح المجهر. بهذه الطريقة ، لديك ثلاث نقاط زرعت بحزم على السطوح خلال تشريح وأصبح من الممكن الآن لجعل التلاعب دقيقة جدا من الملقط. قد يكون هذا الأسلوب يشعر محرجا بعض الشيء في البداية ، ولكن مع الممارسة ، سوف تكون قريبا على درجة الماجستير من تشريح الدماغ. 3. الكبار الدماغ على لوحة 2 أكسيد الكربون ، توجيه الكبار يطير الجانب البطني مع رئيس بعيدا عن يدك. الاستيلاء على الصدر أسفل الرأس. إذا فعلت بشكل صحيح ، فإن تمديد الساقين وخرطوم. أثناء عرض في إطار المجسام ، والاستيلاء على خرطوم موسع مع ملقط لإزالة الرأس. رفض الجسم وغمر الرأس. تركيز على رأس المغمورة. وسوف يتم اجراء تشريح كامل تحت الحل. من المهم جدا التمسك الرأس مع ملقط في جميع الأوقات. خلاف ذلك ، سوف تطفو على رأس ويصعب استردادها. إذا كان رئيس التحركات من التركيز أثناء تشريح ، وتنتقل مرة أخرى في المستوى البؤري دون تعديل المجهر. هذه المهمة قد تبدو بسيطة في البداية تكون صعبة ، ولكن الحفاظ على رأسك في التركيز سوف تصبح أسهل مع مرور الوقت. بدء تشريح التي تمزق النسيج الضام لأول مرة بين خرطوم والعين. المسيل للدموع خلال العين بينما يمسك بحزم مع ملقط واحد على الأقل في كل الأوقات. أن تكون على يقين بأن من أخمص القدمين ملقط ليست سوى مجرد شبكية العين أو تحت إهاب ، لتجنب الإضرار أسفل الدماغ. بالتناوب اليسار واليمين ، واستخدام الملقط الخاص بعيدا المسيل للدموع في الشبكية ، والعمل في اتجاه الجزء الخلفي من الرأس. وتمزيق الشبكية تزيد من فرص ان الصفيحة تبقى موصولة إلى الفص البصري طوال هذه تشريح. تواصل حول الجانب الخلفي من الرأس ، وتمزيق إهاب على طول الطريق. المسيل للدموع خلال العين الأخرى والبدء في سحب بعيدا بشرة. طالما كنت الاستيلاء على بشرة ، وانت تعرف انك لا سحق الدماغ! ومع وضع هذا في الاعتبار ، والاستمرار في سحب إهاب والشبكية بعيدا حتى يتم كشف الدماغ. مرة واحدة في الدماغ مرئيا ، يمكنك أن تبدأ في إزالة القصبة الهوائية التي تعلق على الدماغ (الشكل 1A). مواصلة سحب في القصبة الهوائية وبشرة حتى يتم عزل الدماغ. عند هذه النقطة ، يجب تركيز على الجزء السفلي من الطبق الخاص لرانه المتبقية الخطوات. إزالة القصبة الهوائية المتبقية لأن الدماغ قد تطفو على خلاف ذلك بين عشية وضحاها خلال يغسل الأجسام المضادة. التصوير محطات مبصرة ، فمن المستحسن أن تحتفظ الصفيحة ، ولكن تحتاج إلى إزالة في شبكية العين ، والذي يحتوي على الخلايا والهيئات الصباغ autofluorescent بقوة. للقيام بذلك ، وسحب بعناية في خطها يبقى الخلوية ومصطبغة دون الإضرار الصفيحة. هذا هو المهارة الدقيقة ، ويأخذ الممارسة. يمكن الاحتفاظ الدماغ الكبار على قيد الحياة لساعات أو حتى أيام باستخدام الظروف التي سنبحث في القسم 6. لالمناعية ، فإن الدماغ الكبار على استعداد الآن لتكون ثابتة في الفورمالديهايد. 2 استخدام pipetteman P20 تعيين 5μL لتحريك الدماغ الكبار في حل تحديد قمت أعد مسبقا. يواصل تشريح أدمغة البالغين لمدة 20 دقيقة ، والتي ينبغي أن تسفر 40-10 العقول. مغادرة العقول في الإصلاح لمدة 40 دقيقة إضافية ، ولكن قد تختلف هذه المدة المثلى لتلوين الأجسام المضادة الأولية. إزالة الحل الفورمالديهايد وغسل أدمغة 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل 400μL من محلول يحتوي على برنامج تلفزيوني و 0.4 ٪ TritonX – 100 ، يشار إليها باسم PBS – تريتون. بعد غسله تماما الحل الإصلاح ، قد قمت بإضافة الابتدائي حل الأضداد. 4. الكبار العين يبدأ هذا تشريح كما هو موضح في المخ الكبار. بعد غمر الرأس وإعادة تركيز المجهر ، تبدأ من خلال تمزيق النسيج الضام بين خرطوم والعين. فوق خرطوم ، فصل إهاب من العين. الآن ، فصل إهاب من الجانب السفلي للعين ، والعمل في اتجاه الجزء الخلفي من الرأس. ملقط واحد ، والاستيلاء على المركز من الجزء الخلفي من الرأس. مع الآخر ، والاستيلاء على العين وسحب. تسمح العين لتستقر في قاع الطبق (الشكل 1B). سوف الصفيحة ربما لا تزال تعلق على العين ويمكن أن تستخدم في التصوير الحي للمحطات من خلايا مستقبلة للضوء سليمة تماما في هذا الوقت. على مواصلة العيش مع التصوير الهيئات خلية مستقبلة للضوء ، انتقل إلى القسم 4.5. المقاطع الثلاثة التالية تشرح الثابتة المناعية العين. لالمناعية ، حرك العين لتحديد الحل باستخدام pipetteman P20 تعيين 5μL. يواصل تشريح عيون الكبار لما مجموعه 10 دقائق. ترك عينيه في الإصلاح لمدة 30 دقيقة إضافية. إزالة حل وإجراء إصلاح يغسل كما هو موضح في تشريح الدماغ الكبار. يجب إذا كنت ترغب في نهاية المطاف إلى صورة الهيكل ommatidial من العين يمكن إزالة الصفيحة الآن. عودة أعين ثابتة لتشريح الطبق الخاص بك ، وإزالة أي خلايا القصبة الهوائية أو الدهون التي قد تكون لا تزال تعلق. المقبل ، في حين عقد خارج العين ملقط واحد ، وإزالة الصفيحة مع الآخر. يجب أن تؤتي ثمارها في قطعة واحدة ، ويعرض cellbodies تحت (الشكل 1B). نكون حذرين للاستيلاء على الصفيحة فقط! خلاف ذلك ، هل خطر في فصل مبصرات من شبكية العين. باستخدام pipetteman P20 ، حرك عينيه ل400uL PBS – تريتون في أنبوب 500uL. صخرة بلطف لهم في 4 درجات ليلا لإزالة الصبغة الحمراء autofluorescent من مبصرات. في اليوم التالي ، قد تجاهل وإضافة محلول الغسيل الابتدائي حل الأضداد. لتصوير حي لعيون الكبار نستخدم فقط الذباب pharate الكبار ، أي في وقت متأخر قبل فترة وجيزة مرحلة الشرانق eclosion. في هذه المرحلة ، والهيئات خلية مستقبلة للضوء منفصلة عن محطات في الصفيحة خلال تشريح. Pharate الشرانق الكبار ومحددة جيدا الأجنحة والعينين ، وبشرة وضوحا من خلال حالة العذراء. حدد خادرة وإزالة الجزء الأمامي من حالة العذراء لفضح منطقة الرأس. إزالة بعناية غشاء رقيق الداخلية ان يرفق بالإضافة ذبابة النامية. الاستيلاء على قاعدة للرئيس بالملقط الخاص والجذب. تجاهل بقية خادرة مع الحفاظ على رأس المغمورة. المضي قدما كما هو موضح في تشريح العين المناعية. في المرحلة pharate الكبار ، ومع ذلك ، فإن الهيئات خلية مستقبلة للضوء فصل بسهولة أكثر من الصفيحة ، مما يتيح لك صورة أجسام الخلايا تقع في شبكية العين. أيضا ، لا تزال تعلق على الصفيحة الفص البصري ، مما يتيح لك صورة الصفيحة القاصي. إذا كنت ترغب في صورة الصفيحة القريبة ، حيث يمكن رؤية خراطيش محطة مستقبلة للضوء ، ثم نفذ تشريح العين على ذبابة الكبار حيث بقوة أكبر تعلق الصفيحة إلى العين. 5. تطوير قرص العين والدماغ المجمعات وقد أصبح القرص العين النامية في التنمية العذراء 20 ٪ (P +20 ٪) وجهة مفضلة للتصوير العيش في مختبرنا ملاحظتها بسهولة لأن هذه الطبقة واحدة من خلايا كبيرة نسبيا النامية باستخدام المجهر مبائر 3 لتحديد خادرة 20 ٪ ، وابحث عن نبيبات مالبيغي ، بقعة خضراء ويظهر تحت حالة العذراء ، وتجنب الشرانق التي لديها "الهيئة الظلام" (4). بعد اختيار يغرق P +20 ٪ خادرة ، فإنه في HL3 في الطبق الخاص وإزالة تشريح بعناية على جزء الأمامي من كيس العذراء ، والحرص علىليس لاختراق غشاء رقيق الداخلية. فهم الغشاء الداخلي بالملقط الخاص ومزق. البحث بعناية من خلال نشر محتويات العثور على الدماغ النامية وأقراص العين التي هي بارزة جدا (الشكل 1C). يتم فصل القرص بسهولة بالعين والدماغ المعقدة في هذه المرحلة من التحول. عزل الدماغ في الجزء السفلي من طبق تشريح. منفصلة بعناية الدماغ المركزي من الفص البصري. وسوف تستخدم الفص البصري / العين القرص في التصوير الحي. 6. يعيش التصوير : في المجهر إذا كنت ترغب في الصورة لفترة قصيرة من الوقت في واحد فقط أو اثنين الحلول ، قد صورة الأنسجة الخاصة بك على شريحة زجاجية. في هذه الحالة ، وإعداد الشريحة بواسطة طلاء السطح لأول مرة مع Sylgard باستخدام إرشادات الشركة المصنعة. مكان 20μL HL3 في منتصف الشريحة. تشريح الأنسجة النقل الخاص في 20 ميكرولتر إضافية من HL3 إلى الشريحة. يجب ألا يكون النسيج تعرضها للهواء. بالإضافة ، يجب تجنب أي إجهاد أو سلالة من التعامل مع ماصة أو حل التوتر السطحي. للتصوير العيش ، يجب أن يكون النسيج المضمون بحزم مع الحد الأدنى من التعامل والاتصال. نحن موقف آمن للدماغ باستخدام المياه البلمرة GluShield الغراء من خلال تطبيق الجراحية microelectrode ، وهي تقنية تستخدم بشكل روتيني من أجل التحضير لالجنينية الكهربية 5. الحصول على الزجاج الكهربائي مثل تلك التي سحبت للتسجيلات الكهربية. قطع رأس وملء مع نهاية GluShield باستخدام ضغط الهواء السلبية المتولدة عن طريق الفم. قطع يكفي فقط من القطب الذي قد يدخل الغراء. الآن استخدام الضغط الايجابي لتطبيق كمية صغيرة من الغراء إلى Sylgard تحت قطرة من HL3. الآن ، والمسارعة في النسيج على الغراء ، والحفاظ على التوجه المطلوب لتصوير حي. ويمكن الآن عدسة الغمر بالمياه تستعمل لأجل التصوير. إذا كنت ترغب في إضافة صبغة نفاذية الغشاء ، يمكنك إضافته إلى الحمام بينما التصوير. نستخدم مجهر مسح الرنين متحد البؤر التي تتيح التصوير السريع مع انخفاض 6 photobleaching. التصوير على مدى فترات طويلة من الزمن أو لتبادل الحلول كليا أو عدة مرات ، ونحن نستخدم غرفة التروية (هارفارد IC30 مبائر غرفة التصوير) الذي يربط مضخة تمعجية ان الحل perfuses ببطء على مدى ثقافة الأنسجة الحية (الشكل 2A). حركة التبادل المستمر وسائل الحد الأدنى من الاتصال GluShield تقليل تسطيح للأنسجة التي لوحظت على مدى فترات أطول من الوقت 7. علما بأن للتصوير الفترات الزمنية التنموية والعين والدماغ المعقدة القرص يجب أن يظل سليما وينبغي أن يكون الحد الأدنى من الاتصال مع الغراء. استخدام زلة تغطية المغلفة مع قطرة من Sylgard الذي حلق لجعلها رقيقة ومسطحة. الاستغناء 20μL HL3 على مركز للساترة والغراء الأنسجة الحية للSylgard. إنشاء طوقا من شأنها أن تسمح بالمرور عبر فقاعات الغرفة دون تعريض الأنسجة الحية في الهواء (الشكل 2B). يجب أن تكون سميكة حشية بما يكفي لتجنب سحق أنسجة رقيقة ولكن يكفي لجعل أنسجة بالقرب من عدسة المجهر متحد البؤر ، ونحن نستخدم 250μm في الإعداد لدينا. غرفة تجميع التروية ، والحرص على إبقاء الأنسجة مغمورة تماما في جميع الأوقات. تبدأ في البداية نضح في وثيقة ل100μL سعر للدقيقة الواحدة باستخدام مضخة تمعجية. هذه السرعة بشكل سريع بدلا حسب سمك طوقا الذي يحدد ارتفاع الغرفة. التصوير على مقياس من ساعة ، قد تحتاج إلى إضافة 20 hydroxyecdysone والمضادات الحيوية ، ولكن ليس مضاد ، وتنفيذ نضح بسرعات أقل بكثير حول 10μl في الدقيقة الواحدة. أخيرا ، نحن فقاعة الأوكسجين في مستنبت التي تزود غرفة الارواء. 7. ممثل النتائج : في نهاية بروتوكول لدينا شريط فيديو يظهر لنا مثالا للتصوير يعيشون في البلدان النامية باستخدام خلايا مستقبلة للضوء في إعداد المقدمة في القسم 5. هذا التحضير يستفيد من transgenesis ذبابة الفاكهة الى خلية خصيصا للصحفيين أعرب الفلورسنت. في المثال المبين ، يتم التعبير عن اثنين من الصحفيين الفلورسنت تحت سيطرة السائق GMR – Gal4 مبصرة محددة (8) : غشاء الموسومة myrRFP وعلامة endosomal 2xFYVE GFP – 9. تم الحصول على اثنين من قناة مجموعات البيانات 3D مع مربع من المحيط 70x70x17.5μm وحجم فوكسل من 137x137x700nm (512x512x26) كل 1 دقيقة. الفيلم يظهر طائرة مختارة على مر الزمن في هذا 4D مجموعة البيانات التي تكشف ديناميات الاتجار endosomal داخل الخلايا والأحداث الانصهار الحويصلة. وتظهر الصور التمثيلية للتحضير الأنسجة الثابتة من العين والصفيحة في الشكل. 3.

Discussion

فلوري مجسات مستعملة للتصوير

نحن هنا وصف القوة والضعف في النظام ذبابة الفاكهة إعداد البصرية لمجموعة مختارة من تحقيقات الفلورسنت من ثلاث فئات هي : (1) مجسات التي تمت إضافتها إلى إعداد الأنسجة الحية خارجيا ، (2) البروتينات الفلورية التي يتم ترميز وراثيا عن العيش وكلا التصوير ثابتة ، (3) الأصباغ الفلورية التي تمت إضافتها إلى الأنسجة الثابتة للالمناعية.

1. تحقيقات الخارجية :

DND Lysotracker الأخضر أو الأحمر – 26 – 99 DND (Invitrogen ، المؤتمر الوطني العراقي) وهذه متاحة تجاريا الفلورسنت نفاذية الأغشية المركبات التي تتراكم في مقصورات يحمض بقوة في الخلية ، وأبرزها lysosomes ، الإندوسومات في وقت متأخر ، وautophagosomes. Lysotracker بتركيزات nanomolar (التي نستخدمها عادة 50 نانومتر) تخترق L3 و ف القرص العين +20 ٪ بالكامل في أقل من دقيقة واحدة. منذ Lysotracker تتراكم باستمرار وتمارس تأثيرا القلوية ، ونحن في صورة أقل من 5 دقائق. على النقيض من أقراص العين ، Lysotracker لا تخترق الدماغ دون انقطاع من الأنسجة. ومع ذلك ، حذرا من تمزق الغشاء الخارجي يسمح اختراق الخلية من أقطار عدة في الفص البصري.

Lysosensor DND – 189 (Invitrogen ، المؤتمر الوطني العراقي) وعلى النقيض من Lysotracker ، Lysosensor لا تتراكم في مقصورات يحمض ، ولكن المعارض زيادة درجة الحموضة في مضان الحمضية. وقد تغلغل Lysosensor خصائص مشابهة جدا لLysotracker. نستخدم Lysosensor بتركيز 1μM.

2. المرمزة وراثيا تحقيقات :

بالنسبة للعديد من تجارب التصوير الحي ، فإننا نعرب عن الجينات المرتبطة دلاليا مع جزيئات مختلفة مثل الفلورسنت GFP ، TagRFP ¹⁰ أو pHluorin الحموضة حساسة ^لل11 تحت سيطرة نظام ثنائي التعبير Gal4/UAS ^12. Gal4 خطوط التي تعبر في مبصرات النامية تشمل GMR – Gal4 (جميع مبصرات) ⁸ وmDelta0.5 – Gal4 (R4 النامية وR7) ^13. العديد من سلالة معينة Gal4 سائق توجد خطوط التي تستخدم مختلف المروجين رودوبسين ^14. تحقيقات الفلورية مفيدة بشكل خاص في مجال التصوير تعيش هي بروتينات photoconvertible. وقد استخدمنا بنجاح Dendra2 ، وهو موحودي الأخضر إلى الأحمر البروتين photoconvertable ^15. علما بأن صمم Dendra2 أن photoconvertible باستخدام خط ليزر الأرجون 488nm. ومع ذلك ، نحن غير قادرين على تحقيق التحويل باستخدام الضوء الأزرق مرئية باستخدام لدينا مجموعة المتابعة في أي من النمط التقليدي أو مسح مبائر الرنانة. في المقابل ، مع تحويل ليزر الأشعة فوق البنفسجية هو 405nm كفاءة.

3. المناعية :

فإن العين لا أخلاقي ثابت ، ونحن غالبا ما تختار إما رودامين phalloidin (Invitrogen ، وشركة) أو المضادة للChaoptin (أ الضد مبصرة محددة ¹⁶⁾ لتصور هيكل رابدوميريك (الشكل 1A). وهناك طريقة جيدة لتحليل بنية الصفيحة خرطوشة هو الجمع بين مكافحة chaoptin ¹⁶ ، علامة الدبقية المضادة للخشب الأبنوس ¹⁷ ، و ¹⁸ لمكافحة sec6 (الشكل 1B). كما هو مبين في الشكل. 3 ، وهذا الجمع بين الأضداد يميز الكبرى قبل المشبكي (chaoptin) وبعد المشبكي (sec6) العمليات فضلا عن الدبقية الظهارية (الأبنوس) في الصفيحة ^19.

تجميع الدائرة الإرواء

للتصوير العيش ، ونحن توظيف غرفة نضح تسمح بتبادل البطيء للحلول دون إزعاج إعداد الأنسجة. يتم تضمين مظاهرة التجمع غرفة نضح في شريط الفيديو وأظهرت تخطيطي في الشكل 2. ويتضح من التجمع غرفة نضح في الشكل. 2A. يبدأ وضع طوقا على العينة الأولى ، ويستمر بعد ذلك مع التجمع كما هو مبين. الغرض من طوقا هو خلق مسافة بين قاعدة وغطاء غرفة ، مساحة داخل وهو مختوم النسيج والتي من خلالها سيتم حل التدفق. يجب أن تكون المساحة داخل حشية تشمل مدخل (حل يدخل هنا) ، والإعدادية الأنسجة ، ومنفذ من خلال الحل الذي يترك القاعة. ميزتين من طوقا حاسمة : أولا ، يجب أن تكون سميكة حشية بما يكفي للدماغ بعد رقيقة بما يكفي للسماح التصوير بعدسة ذات دقة عالية. سمك طوقا المثالي يعتمد على مجموعة محددة متابعة المعلمات. الثاني ، وهو الشق في طوقا توفر المقصورة التي تسمح فقاعة بالمرور دون الاتصال العينة (الشكل 2B).

التصوير في مجهر

نستخدم 63x (الفتحة 1.3) عدسة الغمر الغليسيرين للغرفة أو نضح مياه الغمر عدسة 63x مباشرة في مستنبت على شريحة. العدسات الغليسيرين تقديم المزيد من العمل عن بعد من العدسات النفط. نستخدم مجهر المسح الرنانة مبائر الذي يمسح بمعدلات أسرع بكثير من ماسح ضوئي التقليدية (8000 هرتز هرتز مقابل 1400 ، على التوالي). مسح الرنين يسمح 3 الابعاد التسجيلات على مر الزمن في الصيامإيه معدلات الإطار. بالإضافة إلى ذلك ، سرعات مسح خفض كبير ليزر الضيائية ⁽⁶⁾ الذي هو مصدر قلق كبير لاجراء الفحوصات المتكررة من الأنسجة الحية. يجب تحقيق التوازن بين كثافة الليزر والجهد PMT (كسب) لتعظيم إشارة مع التقليل من الضجيج وphotobleaching. وهناك اعتبار مهم آخر هو أن يتم تحديد مقدار تأثير الليزر على منطقة معينة في القرار والتكبير. على سبيل المثال ، يتم فحص منطقة الاختيار في القرار نفسه في 256×256 ، 2x التكبير كما في 512×512 ، والتكبير 1X ، ومع ذلك فإن الحد الأقصى الممكن سرعة التصوير الحي 4 مرات أسرع في 256×256 ، والتكبير 2X. لتسجيل نشاط الخلايا مقصورات تتحرك بسرعة ، لقد سجلنا بنجاح مع الإعدادات التالية : 5 لقطة في Z – المكدس بمعدل واحد ض المكدس في 10 ثوان مع سرعة المسح الضوئي من 8000 هرتز و 2x خط المتوسط. لجلسات التصوير الطويلة على مقياس من الساعات ، ونحن في كثير من الأحيان خفض معدل واحد في إطار لعدة دقائق واختيار مناطق أوسع وإعداد أكثر من المرجح أن التحول.

ذبابة الفاكهة تشريح الجهاز البصري

الشكل 3 يبين تشريح العين الكبار ذبابة الفاكهة (الشكل 3A) ، والدماغ الكبار (الشكل 3B) ، و 20 ٪ -25 ٪ العذراء العين المعقدة القرص / الدماغ (الشكل 3C). ويوضح الشكل 3A العين الكبار على حد سواء مع ودون الصفيحة والخلايا الدهنية المرفقة. أثناء تشريح العين البالغين ، والصفيحة ، والتي هي في وسط العين التي تقع في وعاء يتكون من أجسام الخلايا المستقبلة للضوء (يسار) ، يجب إزالة دون تعطيل الهيئات الخلية تحت (يمين). لتشريح الدماغ الكبار ، وينبغي للمرء أن يكون قادرا على التمييز بين الهيئات خلية مستقبلة للضوء ، الصفيحة ، والفص البصري ، في الدماغ المركزي ، والقصبة الهوائية (الشكل 3B). ومبصرات القصبة الهوائية ويجب إزالتها لهذا التشريح بينما تترك الصفيحة التي تعلق على الفص البصري. للمساعدة في التعرف على 20-25 ٪ العذراء معقدة القرص / الدماغ العين ، وتقدم صورة حية في 3C الشكل.

الشكل 1 (أ) في المخ الكبار. (ب) لا أخلاقي العين. (C) 20 ٪ -25 ٪ معقدة eye-disc/brain العذراء.

الشكل 2 : (أ) تجميع وغرفة الإرواء (B) طوقا المواقع النسبية للعينة.

الشكل 3 : (أ) تلطيخ rhabdomere الكبار استخدام الألغام المضادة للchaoptin. (ب) تلوين الصفيحة الكبار استخدام الألغام المضادة للchaoptin (أخضر ، مبصرات) ، المضادة للخشب الأبنوس (أحمر ، الدبقية) ، وsec6 (أزرق ، interneurons).

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة وولش (I – 1657) ، والمعاهد الوطنية للصحة (RO1EY18884). PRH هو الباحث يوجين مكدرموت في البحوث الطبية الحيوية.

Materials

Material Name	Company	Catalogue Number	Comment
Sylgard 184	Dow Corning	103251252
GluShield	GluStitch, Inc.	GB055QO
20-Hydroxyecdysone	Sigma	H5142-10mg	5mg/ml in EtOH

Special Equipment:

Dissection Scope: Leica Mz12.5 with digital camera
Leica TCS SP5 Confocal Tandem-Scanner Microscope for conventional and resonant scanning live
imaging microscopy, including blue (488nm), green (561nm), orange (594nm) and far-red (633nm) lasers as well as special 63x, 1.4 glycerine and a 63x, 1.3 water immersion lenses.
Harvard Instruments Confocal Imaging Chamber RC-30 and peristaltic pump model 720
Sutter Pipette puller P-97
Software: Amira 5.2, Visage Imaging

References

Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila – A Laboratory Handbook. , (2005).
Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. J Vis Exp. , (2009).
Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).
Ayaz, D. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87 (4), 651-660 (1996).
Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).
Merzlyak, E. M. monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).
Ng, M. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).
Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
Cooper, M. T., Bray, S. J. Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye. Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).
Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
Gurskaya, N. G. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells. J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).
Beronja, S. Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells. J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).
Mehta, S. Q. Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components. Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936, doi:10.3791/1936 (2010).

Automatically Generated