Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

W. Ryan Williamson; P. Robin Hiesinger

doi:10.3791/1936

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biology

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

Published: March 15, 2010

doi:

10.3791/1936

W. Ryan Williamson¹, P. Robin Hiesinger¹

¹Department of Physiology and Green Center for Systems Biology,University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

פרוטוקול זה מתאר שלוש תסיסנית ההכנות: 1) מוח לנתיחה למבוגרים, 2) ברשתית מבוגר לנתיחה ו 3) לפתח דיסק במוח עין לנתיחה קומפלקסים. הדגש מושם על טכניקות הכנה מיוחדת ותנאי הדמיה לחיות, למרות כל ההכנות ניתן להשתמש אימונוהיסטוכימיה רקמות קבוע.

Abstract

תסיסנית המוח ומערכת הראייה מנוצלים נרחב במערכות מודל ללמוד פיתוח העצבית, פונקציה וניוון. כאן אנחנו מראים three ההכנות של המוח ומערכת הראייה כי לכסות את טווח ממתחם בפיתוח עין דיסק המוח המתפתח גלמים בעין הפרט לנתיחה המוח מפני זבובים בוגרים. כל הפרוטוקולים מותאמים לתרבות חיים של ההכנות. עם זאת, אנו מציגים גם את התנאים אימונוהיסטוכימיה רקמות קבוע במקומות המתאימים. לבסוף, אנו מראים התנאים הדמיה לחיות אלה ההכנות באמצעות קונבנציונאלי ומהדהד 4D הדמיה confocal לחיות בתא זלוף. יחד, פרוטוקולים אלה מספקים בסיס הדמיה לחיות על סולמות זמן שונים, החל מבחני תאיים פונקציונלי בקנה מידה של דקות תהליכים התפתחותיים או ניווניות בהיקף של שעות רבות.

Protocol

1. הקדמה בסרטון זה נדגים כיצד להכין מוח תסיסנית ו רשתיות הדמיה אימונוהיסטוכימיה לחיות עם דגש על התאים קולטי האור. ראשית, אנו נראה כיצד להתכונן והניתוחים המוח. בשלב הבא, אנו ממחיש שני חתכים בסיסי נפוץ אימונוהיסטוכימיה כי להוות בסיס ההכנות לחיות. שתי ההכנות הן במוח הבוגר והניתוחים העין. בשלב הבא, נדגים את והניתוחים המשמש הדמיה חיה של המוח המבוגר ופיתוח עם דגש על השימוש שלהם עבור הדמיה חיה של photoreceptors. לבסוף, נתאר כיצד אנו רקמות תמונה חיה להראות כמה דוגמאות של הדמיה חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal התהודה. 2. Dissection הכנה עבור חתכים טוב, אתה צריך מלקחיים חדה. שימוש לחסום חידוד או נייר חול דק מאוד (> 1500), בעדינות להעביר את מלקחיים הלוך ושוב בכל צד עד הקצוות נפגשים בנקודה בסדר. אנו משתמשים אבן השחזה סטנדרטי. אנחנו לא יכסה את טכניקת חידוד כאן, אבל שים לב מלקחיים חדה חיוניים והניתוחים לחיות. אנחנו לחדד מלקחיים לפני כל דיסקציה. עבור חתכים במוח הבוגר, במקום זבובים על בלוק 2 CO להרדים אותם, למיין את הגנוטיפ הרצוי. עבור והניתוחים גלמי, פשוט להגיע לתוך הבקבוקון ובזהירות להסיר גולם עם מלקחיים שלך, להיות זהיר, כדי למנוע שבירה במקרה גלמי. לחלח Kimwipe עם מים. תשתמש במהלך לנתיחה כדי להסיר הפסולת מן מלקחיים שלך. מיקום צלחת לנתח על הבמה של stereoscope ולמלא אותו פתרון HL3 1. והניתוחים כל ייערכו HL3 על מנת להבטיח כי הרקמה נשאר בריא ושלם במהלך ההליך לנתיחה. כמו כן, אנו משתמשים צלחת לנתיחה כי יש כיסוי התחתון של Sylgard להגן מלקחיים במהלך הניתוח. עכשיו, להכין תיקון פתרון, אם אתה מתכנן לבצע אימונוהיסטוכימיה. המקום 180μL של HL3 לתוך צינור microcentrifuge 500μL. הוסף 20μL של פורמלדהיד 37% כדי להשיג פתרון פורמלדהיד 3.7%. לבסוף, עמדת יד תקין חשוב חתכים טובה. עם העמדה יד טובה, מלקחיים שלך יהיה יציב מסוגל, תנועות עדינות בשליטה. ראשית, המקום מלקחיים בצד של האגודל. ואז להביא את האצבע ישר כזה קצה האצבע מונחת על גבי. עכשיו לנוח בצד מלקחיים בצד של האצבע האמצעית שלך ולעבור המנה לנתיחה. ליצור מגע פיזי עם צלחת על ידי האגודל לאצבע האמצעית. בזמן מנוחה האגודל והאמה על צלחת, צמח היד שלך על הבמה מיקרוסקופ. בדרך זו, יש לך שלוש נקודות נטועות היטב משטחים במהלך דיסקציה והיא כיום ניתן לבצע מניפולציות עדינות מאוד של מלקחיים. טכניקה זו עשויים להרגיש קצת מוזר בהתחלה, אבל עם תרגול, אתה בקרוב אמן והניתוחים המוח. 3. למבוגרים המוח על כרית CO 2, להתמצא מבוגר לטוס לצד הגחון עם הראש הרחק ידך. תפוס את בית החזה, ממש מתחת לראש. אם נעשה כראוי, הרגליים חוטם ירחיבו. בעת הצגת תחת stereoscope, לתפוס את חוטם המורחבת עם מלקחיים כדי להסיר את הראש. מחק את הגוף להטביע את הראש. מקדו מחדש על ראשו מתחת למים. דיסקציה כולו יבוצע תחת פתרון. חשוב מאוד להחזיק את הראש עם מלקחיים בכל עת. אחרת, הראש יהיה לצוף קשה לאחזר. אם הראש עובר מתוך התמקדות במהלך דיסקציה, פשוט להזיז אותה חזרה לתוך המטוס מוקד ללא התאמת מיקרוסקופ. זו משימה פשוטה לכאורה עלול להיות קשה בהתחלה, אבל שומר הראש המוקד יהיה קל יותר עם הזמן. בגין לנתיחה על ידי הראשון לקרוע את רקמת החיבור בין חוטם והעין. דמעה דרך העין בעוד מחזיק בחוזקה עם אחד לפחות מלקחיים בכל עת. הייה בטוח כי הבוהן של מלקחיים היא רק מתחת הרשתית או לציפורן, כדי למנוע נזק מתחת למוח. לסירוגין על ימין ועל שמאל, להשתמש במלקחיים שלך לקרוע את הרשתית, עובד לכיוון החלק האחורי של הראש. קורעת את הרשתית יגדיל את הסיכויים כי lamina נשארת מחוברת באונה אופטיים ברחבי לנתיחה זו. המשך סביב האחורי של הראש, קרעו לציפורן לאורך הדרך. דרך דמעה בעין השנייה ולהתחיל מתרחק לציפורן. כל עוד אתה תופס לציפורן, אתה יודע שאתה לא מוחץ את המוח! לאור זאת, ממשיכים למשוך את העור המת הרשתית משם עד המוח מתגלה. ברגע שהמוח הוא גלוי, אתה יכול להתחיל להסיר את קנה הנשימה המצורפת המוח (איור 1A). המשך למשוך את קנה הנשימה ואת לציפורן עד המוח מבודד. בשלב זה, אתה צריך להתרכז לתחתית המנה שלך tהוא הצעדים הנותרים. הסר את קנה הנשימה הנותרים כי המוח שלך יכול אחרת לצוף במהלך שוטף נוגדן לילה. עבור הדמיה של מסופי photoreceptor, רצוי לשמור על lamina, אבל אתה צריך להסיר את הרשתית, אשר מכיל את גופי התא autofluorescent פיגמנט חזק. לשם כך, בזהירות למשוך את השרידים הסלולר עבות פיגמנט מבלי לפגוע lamina. זוהי מיומנות עדינה לוקח בפועל. המוח המבוגר יכול להיות כל הזמן בחיים במשך שעות ואפילו ימים באמצעות תנאים נדון בסעיף 6. עבור אימונוהיסטוכימיה, המוח המבוגר עכשיו הוא מוכן להיות קבוע בפורמלין. 2 השתמש pipetteman P20 מוגדר 5μL להעביר את המוח הבוגר לפתרון לתקן לך כבר מוכן. המשך ביתור מוחות בוגרים במשך 20 דקות, אשר אמור להניב 4-10 המוח. השאירו את מוחם של תיקון 40 דקות נוספות, אולם משך הזמן הזה עשוי להשתנות עבור מכתים אופטימלי נוגדן ראשוני. הסר את פתרון פורמלדהיד לשטוף את מוחם 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד 400μL פתרון המכיל PBS ו – 0.4% TritonX-100, להלן: PBS-טריטון. לאחר שטיפת לחלוטין את הפתרון לתקן, ניתן להוסיף פתרון נוגדן ראשוני. 4. למבוגרים העין בגין זה לנתיחה כמתואר עבור במוח הבוגר. לאחר השריית הראש refocusing מיקרוסקופ, להתחיל לקרוע את רקמת החיבור בין חוטם ואת העין. מעל חוטם, להפריד את לציפורן מן העין. עכשיו, להפריד את לציפורן מן החלק התחתון של העין, עובדים לכיוון החלק האחורי של הראש. עם אחד מלקחיים, לתפוס את מרכז האחורי של הראש. עם זאת, לתפוס את העין ולמשוך. אפשר העין ליישב לתחתית הקערה (איור 1B). Lamina יהיה כנראה עדיין להיות מחוברים העין יכולה לשמש הדמיה חיה של המסופים של תאים photoreceptor שלם לחלוטין בשלב זה. כדי להמשיך לחיות עם הדמיה של גופים photoreceptor התא, עבור לפרק 4.5. שלושת הסעיפים להסביר אימונוהיסטוכימיה עין קבוע. עבור אימונוהיסטוכימיה, להזיז את העין כדי לתקן את הפתרון באמצעות pipetteman P20 מוגדר 5μL. המשך ביתור העיניים מבוגר עבור סכום כולל של 10 דקות. השאר את העיניים לתקן עבור 30 דקות נוספות. הסר את הפתרון לתקן ולערוך שוטף כמתואר לנתיחה המוח הבוגר. אם אתה רוצה בסופו של דבר התמונה ommatidial מבנה העין lamina יש להסיר עכשיו. החזר את העיניים קבוע צלחת המנתחים שלך ולהסיר תאים קנה הנשימה או שומן עדיין יכולים להיות מחוברים. לאחר מכן, כשהוא אוחז את החלק החיצוני של העין עם מלקחיים, להסיר את lamina עם השני. זה צריך לבוא משם בחתיכה אחת, חשיפת cellbodies מתחתיו (איור 1B). היזהר לתפוס את lamina בלבד! אחרת, אתה בסיכון ניתוק photoreceptors מן הרשתית. שימוש pipetteman P20, להזיז את העיניים 400uL PBS-טריטון בצינור 500uL. בעדינות רוק אותם 4 מעלות בלילה כדי להסיר את הפיגמנט האדום autofluorescent מ photoreceptors. למחרת, אתה יכול להשליך את הפתרון לשטוף ולהוסיף פתרון נוגדן ראשוני. הדמיה חיה של עיני מבוגר אנו משתמשים רק זבובים בוגרים pharate, כלומר גלמים בשלב מאוחר, זמן קצר לפני eclosion. בשלב זה, התא photoreceptor גופים נפרדים מסופים lamina במהלך הניתוח. Pharate מבוגר גלמים יש מוגדרים היטב כנפיים, עיניים, ציפורניים גלוי דרך המקרה גלמי. בחר גולם ולהסיר את החלק הקדמי של המקרה גלמי לחשוף את אזור הראש. הסר בזהירות את הקרום הפנימי הדק ובנוסף סוגר את הזבוב מתפתחות. תפוס את הבסיס של הראש עם מלקחיים שלך ולמשוך. מחק את שאר גולם, תוך שמירה על הראש מתחת למים. המשך כפי שמודגם לנתיחה עין אימונוהיסטוכימיה. בשלב הבוגר pharate, לעומת זאת, הגופים תא photoreceptor תנתק בקלות רבה יותר מן lamina, ומאפשר לך את התמונה גופי התא השוכן הרשתית. כמו כן, lamina נשארת מחוברת באונה אופטיים, ומאפשר לך התמונה lamina דיסטלי. אם ברצונך התמונה lamina הפרוקסימלי, בו מסוף מחסניות photoreceptor ניתן לראות, ולאחר מכן לבצע את הנתיחה עין על לטוס מבוגר שבו lamina מחוברת חזק יותר לעין. 5. פיתוח דיסק המוח מתחמי העין הדיסק עין מתפתח פיתוח גלמי 20% (P 20%) הפך האהובים הדמיה לחיות במעבדה שלנו, כי זה שכבה אחת של תאים פיתוח גדולה יחסית ניתן לצפות בקלות באמצעות מיקרוסקופ confocal 3. כדי לבחור גולם 20%, לחפש את tubules malpighian, כתם ירוק מופיע מתחת במקרה גלמי, ולהימנע גלמים שיש להם "גוף אפל" 4. לאחר בחירת לצלול P 20% גולם, אותו HL3 בצלחת שלך לנתח בזהירות להסיר את החלק הקדמי של השק גלמי, נזהרלא לחדור את הקרום הפנימי דק. תפוס את הקרום הפנימי שלך עם מלקחיים ומושכים זה מזה. בזהירות לחפש את התוכן שוחרר כדי למצוא את המוח בפיתוח דיסקים העין אשר בולטים למדי (איור 1C). המתחם דיסק במוח עין מופרד בקלות בשלב זה של מטמורפוזה. לבודד את המוח בתחתית הצלחת הניתוחים. בזהירות להפריד את מוח מרכזי מהאונה אופטיים. דיסק אופטי באונה / עין ישמש הדמיה לחיות. 6. חיים הדמיה: בשעה המיקרוסקופ אם אתם רוצים תמונה לתקופה קצרה של זמן רק אחד או שניים פתרונות, ייתכן התמונה רקמה שלך בשקופית זכוכית. במקרה זה, להכין את השקופית הראשונה על ידי ציפוי פני השטח עם Sylgard באמצעות הוראות היצרן. המקום 20μL HL3 באמצע השקופית. תחבורה רקמה גזור שלך μL 20 נוספים HL3 לשקופית. רקמה לעולם חייב להיות חשוף לאוויר. בנוסף, מתח או מתח מטיפול פיפטה או משטח מתח פתרון יש להימנע. עבור הדמיה חיה, רקמה חייב להיות מאובטח היטב עם טיפול מגע מינימלי. אנו בבטחה בעמדה המוח באמצעות GluShield מים polymerizing דבק כירורגי מיושם באמצעות microelectrode, טכניקה בשימוש שגרתי עבור ההכנות עובריים עבור electrophysiology 5. השג אלקטרודת הזכוכית כמו אלה משכו עבור הקלטות אלקטרו. לנתק את קצה ולמלא את הסוף עם GluShield באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי הפה. לנתק רק מספיק האלקטרודה כי דבק רשאי להיכנס. עכשיו להפעיל לחץ חיובי להחיל כמות קטנה של דבק כדי Sylgard תחת טיפת HL3. עכשיו, להגדיר במהירות את הרקמה על הדבק, שמירה על הכיוון הרצוי עבור הדמיה לחיות. עדשת מים טבילה כעת ניתן להשתמש עבור הדמיה. אם אתה רוצה להוסיף צבע קרום חדיר, אתה יכול להוסיף אותו באמבטיה תוך הדמיה. אנו משתמשים מיקרוסקופ סורק תהודה Confocal שמאפשר הדמיה מהיר עם 6 מופחת photobleaching. הדמיה פני תקופות זמן ארוכות או פתרונות להחליף לחלוטין או מספר פעמים, אנו משתמשים קאמרית זלוף (הרווארד IC30 confocal הדמיה קאמרית) המתחבר משאבה peristaltic כי לאט perfuses פתרון תרבות על רקמת חיים (איור 2 א). התנועה של חילופי נוזלי מתמיד קשר GluShield מינימלי להפחית את שיטוח של הרקמה כי נצפתה על פני תקופות זמן ארוכות יותר 7. שים לב כי עבור הדמיה של תקופות זמן התפתחותי, המורכב דיסק המוח העין צריך להישאר שלם צריך קשר מינימלי עם הדבק. השתמש להחליק מכסה מצופה ירידה של Sylgard כי הוא מגולח לעבד אותו דק ושטוח. לוותר על 20μL HL3 במרכז coverslip ודבק רקמת לחיות Sylgard. צור אטם שיאפשר בועות לעבור חדר בלי לחשוף את הרקמה לחיות לאוויר (איור 2B). אטם צריכה להיות עבה מספיק כדי למנוע ריסוק הרקמה אבל דק מספיק כדי להביא את הרקמה קרוב עדשת מיקרוסקופ confocal, אנו משתמשים 250μm בהגדרות שלנו. להרכיב את תא זלוף, נזהר לשמור על רקמת שקוע לחלוטין בכל עת. בגין זלוף בתחילה לסגור את שער 100μL לדקה באמצעות משאבת peristaltic. מהירות זו היא די מהירה בהתאם לעובי אטם שמגדיר את גובה החדר. עבור הדמיה בקנה מידה של שעות, ייתכן שיהיה צורך להוסיף 20 hydroxyecdysone ו אנטיביוטי, אך לא נגד פטריות, ולבצע זלוף במהירויות נמוכות בהרבה סביב 10μl לדקה. לבסוף, אנו בועת חמצן לתוך המדיום תרבות שמספק את תא זלוף. 7. נציג תוצאות: בסוף פרוטוקול וידאו שלנו אנחנו מראים דוגמא חיה הדמיה בתאים photoreceptor פיתוח באמצעות הכנה שהוצגו בסעיף 5. הכנה זו מנצלת תסיסנית transgenesis לתא, במיוחד להביע את הכתבים ניאון. בדוגמה המוצגת, שני כתבים פלורסנט באים לידי ביטוי תחת שליטה של הנהג GMR-Gal4 photoreceptor ספציפיים 8: הקרום-tagged myrRFP ואת סמן endosomal 2xFYVE-GFP 9. שני ערוצים מערכי נתונים 3D עם תיבה התוחמת של 70x70x17.5μm וגודל voxel של 137x137x700nm (512x512x26) התקבלו כל 1 דקות. הסרט מראה מטוס הנבחרת לאורך זמן במערך הזה 4D מגלה כי הדינמיקה של סחר endosomal תאיים ואיחוי אירועים שלפוחית. תמונות נציג להכנות רקמה קבועה של העין lamina מוצגות באיור. 3.

Discussion

בדיקות ניאון משמש הדמיה

כאן אנו מתארים את נקודות החוזק ואת המגבלות של הכנת תסיסנית מערכת הראייה עבור מבחר של בדיקות ניאון משלוש מחלקות: (1) בדיקות שיתווספו הכנה רקמת חיים exogenously; (2) חלבוני ניאון כי מקודדים גנטית הן לחיות הדמיה קבוע; (3) צבעי ניאון שיתווספו רקמות קבוע אימונוהיסטוכימיה.

1. אקסוגניים בדיקות:

Lysotracker גרין DND-26 או אדום DND-99 (Invitrogen, Inc) אלה זמינים מסחרית פלורסנט קרום חדיר תרכובות להצטבר בתאים acidified חזק בתא, הבולט lysosomes, מאוחר endosomes, ואת autophagosomes. Lysotracker בריכוזים nanomolar (אנו משתמשים בדרך כלל 50 ננומטר) חודר דיסק L3 ו-P עין 20% באופן מלא פחות מדקה אחת. מאז Lysotracker ברציפות מצטבר ו מפעיל השפעה alkalizing, אנו התמונה פחות מ -5 דקות. בניגוד דיסקים העין, Lysotracker לא לחדור למוח ללא הפרעה של הרקמה. עם זאת, נזהר קריעת הקרום החיצוני מאפשר חדירה של קטרים תא כמה באונה אופטיים.

Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc) בניגוד Lysotracker, Lysosensor לא לצבור בתאים acidified, אבל מפגין גדל הקרינה ב-pH חומצי. Lysosensor יש מאפיינים חדירה דומים מאוד Lysotracker. אנו משתמשים Lysosensor בריכוז של 1μM.

2. מקודד גנטית בדיקות:

עבור רבים ניסויים הדמיה לחיות, אנחנו מבטאים גנים מתוייגים עם מולקולות ניאון שונים כמו ה-GFP, TagRFP ¹⁰ או ה-pH רגיש pHluorin ¹¹ תחת שליטה של מערכת בינארית Gal4/UAS הביטוי ^12. Gal4 קווים המבטאים ב photoreceptors בפיתוח כוללים GMR-Gal4 (כל photoreceptors) ⁸ ו-mDelta0.5 Gal4 (פיתוח R4 ו R7) ^13. מספר תת ספציפיים Gal4 נהג קווים קיימים להשתמש יזמים שונים Rhodopsin ^14. בדיקות ניאון שימושי במיוחד בתחום ההדמיה לחיות הם חלבונים photoconvertible. השתמשנו בהצלחה Dendra2, חלבון monomeric ירוק ל-אדום photoconvertable ^15. שים לב Dendra2 נועד להיות photoconvertible באמצעות קו ארגון 488nm לייזר. עם זאת, לא נוכל להשיג באמצעות המרת אור כחול לעין שלנו באמצעות הגדרת במצב או קונבנציונלי או סריקת תהודה confocal. לעומת זאת, המרה עם לייזר UV 405nm יעיל.

3. אימונוהיסטוכימיה:

עבור העין מבוגר קבוע, לעתים קרובות אנו לבחור phalloidin rhodamine (Invitrogen, Inc) או אנטי Chaoptin (נוגדן ספציפי photoreceptor ¹⁶⁾ כדי להמחיש rhabdomeric מבנה (איור 1A). דרך טובה לנתח את מבנה מחסנית lamina היא לשלב אנטי chaoptin ^16, סמן גליה אנטי הובנה ^17, ואנטי sec6 ¹⁸ (1B איור). כפי שמוצג באיור. 3, זה שילוב של נוגדנים המבדיל העיקרי presynaptic (chaoptin) ו postsynaptic (sec6) תהליכים, כמו גם גליה אפיתל (הובנה) ב lamina ^19.

הרכבת לשכת זלוף

עבור הדמיה לחיות, אנחנו מעסיקים קאמרית זלוף המאפשר חילופי איטי של פתרונות מבלי להפריע הכנה רקמות. הפגנה של הרכבה קאמרית זלוף כלול וידאו ומוצגות סכמטי באיור 2. האסיפה של החדר זלוף מתוארת באיור. 2A. בגין על ידי הנחת אטם מעל הדגימה הראשונה, ולאחר מכן להמשיך עם הרכבה כפי שמוצג. מטרתו של אטם היא ליצור רווח בין הבסיס של החדר ואת המכסה, בתוך חלל שבו רקמה היא חתומה באמצעות פתרון אשר יזרמו. החלל בתוך אטם חייב לכלול את כניסת (פתרון נכנס כאן), הכנה רקמות, ולשקע שדרכו פתרון עוזב את החדר. שתי תכונות של אטם הם קריטיים: ראשית, אטם חייב להיות עבה מספיק בשביל המוח עדיין רזה מספיק כדי לאפשר הדמיה עם עדשה ברזולוציה גבוהה. עובי אטם אידיאלי תלויה הגדרת פרמטרים ספציפיים. שנית, חריץ אטם מספק בתא המאפשר בועה לעבור בלי קשר את הדגימה (איור 2B).

הדמיה על המיקרוסקופ

אנו משתמשים עדשה 63x (צמצם 1.3) טבילה גליצרין עבור החדר זלוף או עדשה 63x טבילה במים ישירות לתוך המדיום תרבות בשקופית. עדשות גליצרין לספק יותר עבודה מאשר המרחק עדשות שמן. אנו משתמשים מיקרוסקופ סורק תהודה confocal שסורקת בשיעורים הרבה יותר מהר מאשר סורק קונבנציונאלי (8000 הרץ לעומת 1400 הרץ, בהתאמה). סריקת תהודה מאפשר 3 מימדי ההקלטות לאורך זמן על מהירותאה מסגרת חליפין. בנוסף, מהירות סריקה מהירה יותר להפחית באופן משמעותי phototoxicity ⁶ לייזר אשר הוא החשש העיקרי עבור סריקות חוזרות ונשנות של רקמה חיה. איזון עוצמה לייזר מתח PMT (רווח) חייבת להיות מושגת על מנת למקסם את האות תוך מזעור רעש photobleaching. שיקול נוסף חשוב הוא כי כמות ההשפעה לייזר על איזור מסוים נקבעת על ידי החלטה וזום. לדוגמה, באזור הבחירה נסרק ברזולוציה באותו 256×256, זום 2x ליום 512×512, זום 1x, אך מהירות מקסימלית אפשרית הדמיה לחיות היא 4 פעמים מהר יותר ב 256×256, זום 2x. כדי להקליט את הפעילות של תאים תאיים נע במהירות, יש לנו נרשם בהצלחה עם ההגדרות הבאות: 5 frames per-z מחסנית בקצב של אחד Z-מחסנית ל 10 שניות עם מהירות סריקה של הרץ ו – 8000 בממוצע קו 2x. הפעלות הדמיה ארוך בהיקף של שעות, לעתים קרובות אנו להפחית את שיעור מסגרת אחת לכל כמה דקות ולבחור אזורים גדולים כמו הכנת סביר יותר משמרת.

תסיסנית חזותית האנטומיה מערכת

איור 3 מראה את האנטומיה של העין מבוגר תסיסנית (איור 3A), המוח הבוגר (איור 3B), ו 20% -25% מורכבים גלמי דיסק / עין המוח (איור 3 ג). איור 3A ממחיש את העין למבוגרים עם או בלי lamina ואת בתאי השומן המצורפת. במהלך דיסקציה העין מבוגרים, lamina, אשר נמצא במרכז העין השוכן בקערה שיצרו גופי התא photoreceptor (משמאל), יש להסיר מבלי לשבש את גופי התא מתחתיו (ימין). עבור לנתיחה המוח הבוגר, אחד צריך להיות מסוגל להבחין בין גופי התא photoreceptor, lamina, האונה אופטיים, המוח המרכזי, קנה הנשימה (איור 3B). Photoreceptors ואת קנה הנשימה צורך להסיר לנתיחה זה תוך השארת lamina המצורפת באונה אופטיים. כדי לסייע בזיהוי המורכב של 20-25% גלמי עין דיסק / המוח, תמונה חיה מוצג באיור 3C.

באיור 1. (א) במוח מבוגר. (ב) בוגר העין. (ג) 20% -25% מורכבים גלמי eye-disc/brain.

איור 2. (א) חדר זלוף הרכבה (ב) מיקום אטם יחסית הדגימה.

איור 3. (א) מכתים rhabdomere למבוגרים באמצעות אנטי chaoptin. (ב) lamina למבוגרים מכתים באמצעות אנטי chaoptin (ירוק, photoreceptors), אנטי הובנה (אדום, גליה), ו sec6 (כחול, interneurons).

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קרן וולש (I-1657) ו-NIH (RO1EY18884). PRH הוא חוקר יוג'ין מק 'דרמוט במחקר ביו.

Materials

Material Name	Company	Catalogue Number	Comment
Sylgard 184	Dow Corning	103251252
GluShield	GluStitch, Inc.	GB055QO
20-Hydroxyecdysone	Sigma	H5142-10mg	5mg/ml in EtOH

Special Equipment:

Dissection Scope: Leica Mz12.5 with digital camera
Leica TCS SP5 Confocal Tandem-Scanner Microscope for conventional and resonant scanning live
imaging microscopy, including blue (488nm), green (561nm), orange (594nm) and far-red (633nm) lasers as well as special 63x, 1.4 glycerine and a 63x, 1.3 water immersion lenses.
Harvard Instruments Confocal Imaging Chamber RC-30 and peristaltic pump model 720
Sutter Pipette puller P-97
Software: Amira 5.2, Visage Imaging

References

Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila – A Laboratory Handbook. , (2005).
Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. J Vis Exp. , (2009).
Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).
Ayaz, D. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87 (4), 651-660 (1996).
Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).
Merzlyak, E. M. monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).
Ng, M. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).
Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
Cooper, M. T., Bray, S. J. Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye. Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).
Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
Gurskaya, N. G. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells. J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).
Beronja, S. Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells. J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).
Mehta, S. Q. Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components. Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936, doi:10.3791/1936 (2010).

Automatically Generated