Magnetic Resonance Spectroscopy von Live- Drosophila melanogaster Verwendung von Magic Angle Spinning
Summary
Diese Technik ermöglicht den Einsatz von hochauflösenden magic angle spinning Protonen MR-Spektroskopie (HR-MAS-1H-MRS) für die molekulare Charakterisierung von Live-<em> Drosophila melanogaster</em> Mit einem herkömmlichen 14,1-Tesla-Spektrometer mit einer HR-MAS-Sonde ausgestattet.
Abstract
High-Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS-) Protonen-Magnetresonanz-Spektroskopie (<sup> 1</sup> H-MRS) ist ein neuartiges zerstörungsfreies Verfahren, das spektrale Linienbreiten verbessert und ermöglicht hochauflösende Spektren von Extrakten, intakte Zellen, Zellkulturen, und vor allem intakte Gewebe gewonnen werden, um Beziehungen zwischen Metaboliten und zellulären Prozesse zu untersuchen.<em> In-vivo-</em> HR-MAS-<sup> 1</sup> H-MRS Studien stehen noch in der Live-Fruchtfliege gemeldet werden<em> Drosophila melanogaster.</em><em> Drosophila,</em> Als einfachere genetische Organismus, ermöglicht die vielfältigen biologischen Funktionen und verschiedenen evolutionär konservierte Signalwege auf den gesamten Organismus-Ebene untersucht werden und es ist ein nützliches Modell für die Untersuchung von Genetik und Physiologie. Zu diesem Zweck entwickelten wir und umgesetzt<em> In vivo</em> HR-MAS-<sup> 1</sup> H-MRS-Methode zu untersuchen, zu leben<em> Drosophila</em> Mit 14,1 T. Hier skizzieren wir ein HR-MAS-<sup> 1</sup> H-MRS-Protokoll für die molekulare Charakterisierung von<em> Drosophila</em> Mit einem herkömmlichen MR-Spektrometer mit einer HR-MAS-Sonde ausgestattet. Diese Technik ist ein neuartiges,<em> In vivo,</em> Nicht-destruktiven<em> Drosophila</em> Metabolit Messung Ansatz, der die Identifizierung von krankheitsrelevanten Biomarkern ermöglicht und somit können neue therapeutische Entwicklung beitragen.
Protocol
Discussion
Mit Ausnahme des jüngsten Berichts über die Durchführbarkeit der in-vivo-MRT in Fruchtfliegen 6 haben in vivo MRS-Studien in Drosophila noch nicht berichtet worden. In der vorliegenden Protokoll, beschreiben wir die Implementierung eines neuartigen In-vivo-HR-MAS-1 H-MRS-Ansatz zum Nachweis von biologisch wichtigen Molekülen. Insbesondere wiesen wir Lipiden und kleinen Metaboliten in lebenden Drosophila-Fliegen mit 14,1 T in etwa 45 min, die eine ang…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch einen National Institutes of Health (NIH) gewähren AI063433 zu Laurence G. Rahme, ein National Institute Institutes of Health (NIH) Center Grant (P50GM021700) Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, Direktor der unterstützten der NMR-Kern) und eine Shriner Hospital for Children Forschungsstipendium (# 8893) an A. Aria Tzika. Wir danken Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. für die Unterstützung in den ersten Phasen der Entwicklung dieses Protokolls und Ovidiu C. Andronesi Ph.D. für die Unterstützung bei der TOBSY Pulssequenz.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific Corporation | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Bio-Spin | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Bio-Spin | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Bio-Spin | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectra
analysis
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
