Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

1) Hücre hazırlık Yapışık hücrelere kullanırken, trypsinize ve elektroporasyon önce hücreleri toplamak için gereklidir. Üç farklı geçit numaraları temsil eden dört fare embriyonik fibroblast (MEF) kültürleri, arasında transfeksiyon karşılaştırmak için, her bir şişesi aşağıdaki gerçekleştirin. Hücre kültür ortamı aspire. Hücreleri yıkamak için PBS ekleyin. PBS çıkarın; hücreleri kapsayacak şekilde yeterli tripsin ve tripsin hücreleri ayırmak için izin vermek için birkaç dakika bekleyin. Hücrelerin durumunu doğrulamak için bir mikroskop ile şişeler kontrol hücreleri ayırmak için balon şaplak ve sonra, emin hücreleri tüm müstakil olmak için tekrar şişeyi kontrol edin. Ek süre ve gerekirse tekrar bekleyin. Tüm hücreleri müstakil sonra, tripsin nötralize etmek için serum içeren medya ekleyin. Hücrelerin bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj yoluyla pelet hücreleri (RCF = 300 xg). PBS bilinen bir ses supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Hücreleri saymak. Uygun hacimli hücre süspansiyonu, deneyler için hücreler (1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu hücreleri de ortalama 150 mcL gerekecektir) gerekli sayıda sağlamak için yeni bir tüpe aktarın . Santrifüj hücreleri. Gene Verici elektroporasyon 1 x 10 6 hücre / mL bir hücre yoğunluğu elde etmek için tampon uygun hacmi supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Hücre süspansiyonu plazmid başına mL 20 mg ekleyin ve hafifçe karıştırın. 2) Elektroporasyon damar kurulum ve elektroporasyon Plaka kurulum ve elektroporasyon Gene Verici MXcell elektroporasyon sisteminin güç modülü takın plaka odası. Pipet 150 mcL hücre karışımı ya da 96-kuyu elektroporasyon plaka kuyu içine tampon. Plaka odası ve nabız plaka koyun. Odasından plaka çıkarın. Her bir kuyunun içinde yukarı ve aşağı pipetleme iyi içeriği karıştırın. Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın. Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak. Hücreler 24 saat kurtarmanızı sağlar. Küvet kurulum ve elektroporasyon ShockPod Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve fiş ™ küvet kamara güç modülü plaka odasına çıkarın. Pipet 600 mcL 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvet içine hücre süspansiyonu. ShockPod odasına küvet koyun ve elektrik darbe sağlamak. Küvet odasından çıkarın. Küvet içinde yukarı ve aşağı pipetleme küvet içeriğini karıştırın. Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın. Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak. Hücreler 24 saat geri alalım. 3) Temsilci Sonuçlar Hücreleri transfecting ve onları kurtarmak için izin sonra, flow sitometri kullanarak epifluorescent mikroskopi kullanılarak kantitatif, kalitatif transfeksiyon verimlilik, analiz ve. Şekil 1. başarıyla electroporated ve şimdi, GFP geninin ifade Hücreler epifluorescent mikroskobu altında görünür. Şekil 2 faz kontrast altında hücreleri görüntüleme hem transfekte ve untransfected hücrelerinin görselleştirme sağlar. Bunlar 200V düşük voltaj elektroporasyon darbe maruz kaldılar hücrelerdir. Hücreler yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyük ölçüde konfluent. Şekil 3, Epifloresans altında bakış aynı alanda bir dizi hücreleri GFP işaretleyici ifade gösterir, ama bu sadece küçük bir yüzdesi önceki resim görünür hücreleri . Şekil 4 250V, faz kontrast altında görülen canlı hücrelerinin toplam sayısı biraz azalır. Epifloresans altında bir Şekil 5 GFP ifade hücrelerinin sayısının arttığını görebilirsiniz. Şekil 6, en yüksek voltaj 375V uygulanan, daha az görünür canlı hücreler vardır. Şekil 7 Ancak, geri kalan hücreler büyük bir yüzdesi, GFP ifade edilmektedir. Hangi durum optimal deney tasarımı bağlıdır. Bazı deneylerde transfekte hücrelerinin en büyük sayı diğer deneylerde en yüksek yüzde transfeksiyon belki de en iyisi, en uygun olabilir. Biz her koşul altında olumlu GFP ve yüzdeleri hücre yaşla birlikte değişir hücrelerin yüzdesi olarak ilgilenen. Flow sitometri, her farklı elektroporasyon koşullar altında transfeksiyon sonuçları hakkında kantitatif bilgi sağlayabilir. Şekil 8 12 elektroporasyon koşulların her birinin altında 5 hücre gösterilen pasajda olumlu GFP hücre yüzdesi. Durumu 12, maksimum transfeksiyon yüzdesi güçlü kare dalga darbe altında yüksek voltaj üstel çürüme darbe, durumu 6 ve% 70 altında yaklaşık% 80, test. Şekil 9 hücrelerin elektroporasyon önce 9 kez geçti, transfeksiyon yüzde genel desen neredeyse aynıdır, ancak çok hafif bir azalma ile transfeksiyon yüzdeleri. Şekil 10 Burada gösterilen geçit genç hücrelere göre transfeksiyon yüzdesinde belirgin bir azalma göstermektedir 13 hücreler, GFP hücrelerinin yüzdeleri. En yüksek transfeksiyon yüzdeleri yaklaşık yarısı, mümkün olduğu kadar kısa sürede izolasyon sonra sağlıklı hücreleri kullanarak önemini gösteren genç hücreleri ne ile elde edildi. Gene Verici MXcell kullanarak transfecting MEF hücreleri için kullanılan Elektroporasyon Koşullar Durumu (1-6) Üstel Bozunma bakliyat, 350 uF, 1000ohm Voltaj (V) 1 200 2 250 3 300 4 326 5 350 6 376 Durumu (7-12) Kare Dalga bakliyat, 2000 uF, 1000 ohm ve 1 darbe Voltaj (V) Darbe Süresi (ms) 7 200 10 8 250 10 9 300 10 10 200 20 11 250 20 12 300 20