1) preparação celular Ao usar células aderentes, é necessário trypsinize e recolher as células antes da eletroporação. Para comparar transfecção entre os quatro embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) culturas, representando três diferentes números de passagem, execute o seguinte em cada frasco. Aspirar off meios de cultura celular. Adicionar PBS para lavar células. Remover PBS; adicionar tripsina suficiente para cobrir as células, e aguarde alguns minutos para permitir tripsina para separar células. Verifique frascos com um microscópio para verificar a condição das células, smack frasco para retirar as células, e depois verificar frasco novamente para fazer as células se são todos destacados. Esperar mais tempo e repetir se necessário. Uma vez que todas as células são separadas, adicionar soro para neutralizar a mídia contendo tripsina. Transferência de células para um tubo de centrifugação e as células de pelotas por centrifugação (300 xg = rcf). Remover as células sobrenadante e ressuspender em um volume conhecido de PBS. Contagem de células. Transferência para um novo tubo o volume apropriado de suspensão de células para fornecer o número necessário de células para experiências (você precisará de 150 mL de células por poço, a uma densidade de 1 x 10 6 células / mL). Células centrífuga. Remover as células no sobrenadante e ressuspender o volume apropriado de Gene tampão de eletroporação Pulser para conseguir uma densidade de células de 1 x 10 6 células / mL. Adicionar 20 mg de mL por plasmídeo de suspensão de células e misture delicadamente. 2) a configuração navio Eletroporação e eletroporação Configuração de placa e eletroporação Câmara de plugue placa no módulo de potência do sistema de eletroporação Gene Pulser MXcell. Pipetar 150 mL mistura de células ou tampão em poços de uma placa de eletroporação de 96 poços. Colocar placa na câmara de placa e de pulso. Retire a placa da câmara. Misture bem o conteúdo pipetando cima e para baixo em cada poço. Transferência de células de cada poço para pré-aquecido tampão em 12-lamelas. Toque placa para distribuir células e colocá-lo em incubadora. Vamos recuperar as células por 24 horas. Cuvete de configuração e eletroporação Desligue câmara de placa do módulo de potência do sistema de eletroporação Gene Pulser MXcell e conecte o ShockPod ™ cuvete câmara. Pipetar 600 mL da suspensão de células em uma cubeta de eletroporação 0,4 centímetros lacuna. Coloque tina em câmara ShockPod e entregar pulso elétrico. Remover cuvete da câmara. Mix conteúdo cuvete pipetando cima e para baixo na cuvete. Transferência de células de cada poço para pré-aquecido tampão em 12-lamelas. Toque placa para distribuir células e colocá-lo em incubadora. Vamos recuperar as células por 24 horas. 3) Resultados Representante Depois transfecting células e que lhes permita recuperar, analisar a eficiência de transfecção qualitativamente, por microscopia de epifluorescência, e quantitativamente, utilizando citometria de fluxo. Figura 1. Células que foram sucesso electroporated e agora estão expressando o gene GFP aparecem sob microscopia de epifluorescência. Figura 2. Vendo as células em contraste de fase permite a visualização de ambas as células transfectadas e untransfected. Estas são as células que foram expostas ao pulso de tensão menor eletroporação em 200V. As células são em grande parte confluentes devido à alta densidade celular. Figura 3. O mesmo campo de visão sob epifluorescência mostra um número de células estão expressando o marcador GFP, mas estes são apenas uma pequena porcentagem das células visíveis na imagem anterior. Figura 4. Em 250V, o número total de células vivas visto sob contraste de fase diminui ligeiramente. Figura 5. De acordo com epifluorescência, pode-se ver que o número de células expressando GFP tem aumentado. Figura 6. No mais alto da tensão aplicada, 375V, há menos células vivas visível. Figura 7. No entanto, uma grande porcentagem das células restantes estão expressando GFP. Que condição é ideal depende do delineamento experimental. Em alguns experimentos o maior número de células transfectadas pode ser bom, em outros experimentos a transfecção maior percentual poderia ser melhor. Estamos interessados no percentual de células que são GFP positivos em cada condição e como os percentuais variam com a idade das células. Citometria de fluxo pode fornecer informações quantitativas sobre os resultados transfecção em cada uma das condições de eletroporação diferentes. Figura 8. Aqui, a porcentagem de células que são GFP positivas na passagem de cinco células em cada uma das 12 condições eletroporação são mostrados. O percentual máximo de transfecção foi de aproximadamente 80% maior sob o pulso de tensão de decaimento exponencial, condição 6, e 70% sob o pulso forte onda quadrada testada, a condição 12. Figura 9. Com as células passaram nove vezes antes da eletroporação, o padrão geral de transfecção percentual é quase idêntico, mas com uma diminuição muito ligeira no percentual de transfecção. Figura 10. Mostrado aqui são as percentagens de células GFP na passagem 13 células que mostram uma queda acentuada na porcentagem de transfecção em relação às células mais jovens. Os maiores porcentagens de transfecção foram de aproximadamente metade do que foi alcançado com as células mais jovens demonstrando a importância do uso de células saudáveis, logo após o isolamento possível. Condições eletroporação usada para as células usando o MEF transfecting Gene Pulser MXcell Condição (1-6) Exponencial pulsos Decay, todos com 350 uF, 1000OHM Tensão (V) 1 200 2 250 3 300 4 326 5 350 6 376 Condição (7-12) Onda pulsos quadrados, todos com 2,000 uF, 1000 ohm, e 1 de pulso Tensão (V) Duração de pulso (ms) 7 200 10 8 250 10 9 300 10 10 200 20 11 250 20 12 300 20
