1) Zellpräparation Bei der Verwendung von anhaftenden Zellen, ist es notwendig, trypsinize und sammeln die Zellen vor der Elektroporation. Zum Vergleich Transfektion unter den vier embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Kulturen, die drei anderen Stelle Zahlen, gehen Sie wie folgt auf jeder Flasche. Absaugen Zellkulturmedien. Add PBS, um Zellen zu waschen. Entfernen PBS; add ausreichend Trypsin, um Zellen bedecken und einige Minuten warten, damit Trypsin, um Zellen zu lösen. Überprüfen Sie Flaschen mit einem Mikroskop, um den Zustand der Zellen zu überprüfen, smack Kolben auf Zellen zu trennen, und dann überprüfen Kolben erneut, um sicherzustellen Zellen sind alle gelöst. Warten Sie zusätzlich Zeit und bei Bedarf wiederholen. Wenn alle Zellen abgelöst werden, fügen Serum mit Medien Trypsin zu neutralisieren. Transfer-Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und Pellet-Zellen durch Zentrifugation (RZB = 300 xg). Überstand entfernen und die Zellen in einem bekannten Volumen von PBS. Zählen von Zellen. Transfer in ein neues Röhrchen das entsprechende Volumen der Zellsuspension die erforderliche Anzahl von Zellen für Experimente (Sie werden 150 ul Zellen pro Vertiefung in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml benötigen) liefern können. Centrifuge Zellen. Überstand entfernen und die Zellen in dem entsprechenden Volumen Gene Pulser Elektroporationspuffer auf eine Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen / ml erreichen. Add 20 ug von Plasmid pro ml Zellsuspension und vorsichtig mischen. 2) Die Elektroporation Schiff Setup und Elektroporation Platte Setup und Elektroporation Steckerplatte Kammer in den Leistungsteil des Gene Pulser MXcell Elektroporation System. Je 150 ul Zellgemisch oder Puffer in die Vertiefungen einer 96-well Platte Elektroporation. Legen Sie Platte in Platte Kammer und Puls. Entfernen Platte aus der Kammer. Gut mischen Inhalte durch Auf-und Abpipettieren in jede Vertiefung. Übertragen Sie die Zellen aus jedem gut vorgewärmten Puffer in 12-Well-Platten. Tippen Sie auf Teller verteilen Zellen und steckte es in Inkubator. Lassen Zellen für 24 Stunden zu erholen. Cuvette Setup und Elektroporation Ziehen Sie Lamellenraum aus dem Leistungsteil des Gene Pulser MXcell Elektroporation System und stecken Sie den ShockPod ™ Küvette Kammer. Pipette 600 ul Zellsuspension in ein 0,4 cm Abstand Elektroporationsküvette. Put Küvette in ShockPod Kammer und liefern elektrischen Impuls. Entfernen Küvette aus der Kammer. Mix Küvette Inhalte durch Auf-und Abpipettieren in Küvette. Übertragen Sie die Zellen aus jedem gut vorgewärmten Puffer in 12-Well-Platten. Tippen Sie auf Teller verteilen Zellen und steckte es in Inkubator. Lassen Sie die Zellen für 24 Stunden zu erholen. 3) repräsentative Ergebnisse Nach Transfektion von Zellen und erlaubt ihnen, Wiederherstellung, Analyse der Transfektionseffizienz qualitativ mit Epifluoreszenzmikroskopie und quantitativ mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Abbildung 1. Cells, die erfolgreich elektroporiert und sind nun Ausdruck des GFP-Gens erscheinen unter Epifluoreszenzmikroskopie. Abbildung 2. Anzeigen der Zellen unter Phasenkontrast ermöglicht die Visualisierung der beiden transfizierten und nicht transfizierten Zellen. Dies sind die Zellen, die die niedrigste Spannung Elektroporation Puls bei 200 V ausgesetzt waren. Die Zellen sind weitgehend konfluenten aufgrund der hohen Zelldichte. Abbildung 3. Das gleiche Sichtfeld unter Epifluoreszenz zeigt eine Anzahl von Zellen sind Ausdruck der GFP-Marker, aber diese sind nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen sichtbar in dem vorhergehenden Bild. Abbildung 4. Bei 250V, verringert sich die Gesamtzahl der lebenden Zellen unter Phasenkontrast gesehen leicht. Abbildung 5. Under Epifluoreszenz, kann man sehen, dass die Anzahl der GFP exprimierenden Zellen erhöht hat. Abbildung 6. Auf der höchsten Spannung, 375V, gibt es weniger lebende Zellen sichtbar. Abbildung 7. Allerdings sind ein Großteil der restlichen Zellen, die GFP. Welche Bedingung ist optimal, hängt von den experimentellen Design. In einigen Experimenten wurde die größte Anzahl an transfizierten Zellen könnte optimal sein, in anderen Experimenten der höchste Prozentsatz der Transfektion wohl am besten sein. Wir interessieren uns für den Prozentsatz an Zellen, die GFP positive unter jeder Bedingung und wie die Prozentsätze variieren mit Zell-Alter sind. Die Durchflusszytometrie kann liefern quantitative Information über die Transfektion Ergebnisse, die unter jedem der verschiedenen Elektroporation Bedingungen. Abbildung 8. Hier ist der Anteil der Zellen, die GFP positive in den Kanal 5 Zellen unter jedem der 12 Elektroporation Bedingungen gezeigt werden. Die maximale Transfektion Anteil von ca. 80% unter der höchsten Spannung exponentiellen Abfall Puls, Zustand 6, und 70% unter dem stärksten Rechteckimpuls getestet, Zustand 12. Abbildung 9. Mit der Zellen weitergegeben 9 Mal vor der Elektroporation, das allgemeine Muster der Transfektion Prozentsatz nahezu identisch ist, aber mit einem sehr leichten Rückgang der Transfektion Prozentsätze. Abbildung 10. Sehen Sie hier die Anteile der GFP-Zellen in der Passage 13 Zellen, die zu einem deutlichen Rückgang in der Transfektion Prozentsatz im Vergleich zu den jüngeren Zellen zeigen. Die höchsten Prozentsätze wurden Transfektion etwa die Hälfte, was mit den jüngeren Zellen demonstriert die Bedeutung der Verwendung gesunden Zellen so bald nach der Isolierung wie möglich erreicht. Elektroporation Bedingungen für die Transfektion von MEF-Zellen mit dem Gene Pulser MXcell verwendet Zustand (1-6) Exponentiellen Abfall Impulse, alle mit 350 uF, 1000OHM Spannung (V) 1 200 2 250 3 300 4 326 5 350 6 376 Condition (7-12) Rechteckimpulse, Alle mit 2000 uF, 1000 ohm, und 1 Impuls Spannung (V) Impulsdauer (ms) 7 200 10 8 250 10 9 300 10 10 200 20 11 250 20 12 300 20
