1) Сотовые подготовки При использовании прилипшие клетки, необходимо, чтобы trypsinize и сбора клеток до электропорации. Для сравнения трансфекции среди четырех мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) культур, представляющих три разных номера проход, выполнять следующие действия на каждом колбу. Аспирируйте от СМИ культуре клеток. Добавить PBS мыть клетки. Удалить PBS, добавить достаточное для покрытия трипсина клетки, и подождите несколько минут, чтобы дать трипсина отделить клетки. Проверьте колбы с микроскопом, чтобы проверить состояние клетки, отдающие колбу отделить клетки, а затем проверить колбу снова, чтобы убедиться, все клетки отсоединяются. Подождите, дополнительное время и повторите, если необходимо. После того как все клетки отделяются, добавить сыворотку, содержащую средства массовой информации для нейтрализации трипсина. Передача клетки центрифуге трубки и гранул клетки центрифугированием (RCF = 300 мкг). Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в известном объеме PBS. Граф клеток. Переезд в новую пробирку соответствующий объем клеточной суспензии для обеспечения необходимого количества клеток для экспериментов (требуется 150 мкл клеток на лунку при плотности 1 х 10 6 клеток / мл). Центрифуга клеток. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в соответствующий объем гена Pulser электропорации буфера для достижения плотности клеток 1 х 10 6 клеток / мл. Добавьте 20 мкг плазмидной на мл клеточной суспензии и аккуратно перемешать. 2) Электропорация установки судна и электропорация Установка плиты и электропорация Вставьте пластину в камере силовой модуль гена Pulser система электропорации MXcell. Внесите 150 мкл смеси клеток или буфера в лунки 96-луночного электропорации пластины. Положите пластины в камере пластины и пульс. Удалите пластину от камеры. Хорошо перемешать содержимое с помощью пипетки вверх и вниз в каждую лунку. Передача клетки из каждой лунки предварительно нагревается буфера в 12-луночных планшетах. Нажмите пластину для распространения клеток и положил его в инкубатор. Давайте восстанавливать клетки в течение 24 часов. Кювета установки и электропорация Отключите пластины камеры от силового модуля гена Pulser MXcell система электропорации и подключить ShockPod ™ кювет камеры. Внесите 600 мкл суспензии клеток в 0,4 см кювете электропорации пробел. Поместите кювету в камере ShockPod и доставить электрическим импульсом. Удалите кювету с камеры. Смешайте содержимое кюветы с помощью пипетки вверх и вниз в кювет. Передача клетки из каждой лунки предварительно нагревается буфера в 12-луночных планшетах. Нажмите пластину для распространения клеток и положил его в инкубатор. Давайте восстанавливать клетки в течение 24 часов. 3) Результаты представитель После трансфекции клеток и позволяет им восстановиться, проанализировать эффективность трансфекции качественно, с использованием epifluorescent микроскопии и количественно, с использованием проточной цитометрии. Рисунок 1. Клетки, которые были успешно электропорации и теперь выражения GFP ген появляются под epifluorescent микроскопии. Рисунок 2. Просмотр клетки под фазового контраста позволяет визуализировать как трансфекции и untransfected клеток. Эти клетки, которые подвергались воздействию низких импульса электропорации напряжение на 200В. Клетки в значительной степени сливающийся из-за высокой плотности клеток. Рисунок 3. Же поле зрения при epifluorescence показывает количество клеток выражают маркера GFP, но это лишь небольшой процент от клетки видны в предыдущее изображение. Рисунок 4. На 250В, общее число живых клеток видеть под фазового контраста немного уменьшается. Рисунок 5. Под epifluorescence, можно увидеть, что число клеток, экспрессирующих GFP возросла. Рисунок 6. На самом высоком напряжении, 375V, Есть меньше живых клеток видны. Рисунок 7. Тем не менее, большая часть оставшихся клеток выражают GFP. Какие условия оптимального зависит от эксперимента. В некоторых экспериментах наибольшее число трансфекции клеток может быть оптимальным, и в других экспериментах высокий процент трансфекции могло бы быть лучше. Мы заинтересованы в процент клеток, которые являются положительными GFP под каждое условие и как проценты меняются в зависимости от ячейки возраста. Проточная цитометрия может дать количественную информацию о трансфекции результаты по каждому из различных условий электропорации. Рисунок 8. Здесь процент клеток, которые являются положительными GFP в коридоре 5 клеток в каждом из 12 условий электропорации показаны. Максимальный процент трансфекции была примерно на 80% при высоком напряжении экспоненциального импульса распада, условие 6, а 70% под сильнейшим квадратных пульсовой волны испытания, состояние 12. Рисунок 9. С клетки прошли в 9 раз до электропорация, общая картина трансфекции процент почти идентичны, но с очень незначительное снижение трансфекции процентах. Рисунок 10. Здесь показаны доли GFP клеток в проход 13 клеток, которые показывают заметное снижение трансфекции процентах по отношению к младшим клеток. Высокий процент трансфекции были примерно вдвое меньше, чем была достигнута с молодых клеток демонстрирует важность использования здоровые клетки, как только после выделения насколько это возможно. Электропорация условия для трансфекции клеток с использованием MEF Гена Pulser MXcell Условие (1-6) Экспоненциальный распад импульсов, всех с 350 мкФ, 1000ohm Напряжение (В) 1 200 2 250 3 300 4 326 5 350 6 376 Условие (7-12) Импульсы прямоугольной формы, всего с 2000 мкФ, 1000 Ом и 1 импульс Напряжение (В) Длительность импульса (мс) 7 200 10 8 250 10 9 300 10 10 200 20 11 250 20 12 300 20
