Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama
Summary
Analitik ultrasantrifüjdeki (EAA) örnek hücre örnek ve referans tampon ve deneyler sırasında tutar ve yüksek vakum ve 60.000 rpm rotor hızlarına maruz kalmaktadır. Bu video EAA bir deney bu çok önemli bir bileşeni montaj, yükleme ve uyum için gerekli ayrıntısına kadar titiz bir dikkat gösterecektir.
Abstract
Analitik ultrasantrifüjdeki (EAA), bize yüksek hızda santrifüj sırasında makromoleküler sedimantasyon profilleri kaydetmenize olanak verir bir güçlü biyofiziksel bir araçtır. Düzgün bir şekilde planlandığı ve yürütüldüğü, EAA sedimantasyon hızı veya sedimantasyon denge deneyi bir boyut ve şekil bakımından protein, örnek saflığı, sedimantasyon katsayısı, oligomerization devletler ve protein-protein etkileşimleri hakkında çok şey ortaya çıkarabilir.
Bu teknik, ancak sıkı bir düzeyde teknik dikkat gerektirir. Örnek hücreleri iki pencere meclisleri arasında sıkışmış bir sectored merkezi parçası tutun. Onlar / lbs yaklaşık 120-140 tork basıncı ile mühürlenir. Hızlarda dönerken optik algılama sistemleri, her merkezinde sektör kanalıyla aynı radyal yolu orta hat örnek ve referans tampon tarama Referans tampon ve böylece örnek merkezinde sektörleri içine yüklenir ve sonra sızdırmazlık sonra, hücrelerin tam bir titanyum rotor hizalanır 60, 000 rpm ve çok yüksek vakum altında
Sadece uygun örnek hücre montaj kritik, örnek hücre parçaları çok pahalı ve deneyler sırasında kaçak ve kırılmaları önlemek için en iyi çalışma koşullarını sağlamak için dikkat edilmesi gerekir. Hatta en ufak bir çatlak veya çizik santrifüj kırılmaya neden olabilir, dikkatli bir şekilde pencereler taşıyınız. Merkezinde ve pencereler arasında iletişim mümkün olduğunca sıkı olmalıdır; tork basınç uygulandıktan sonra, yani hiçbir Newton halkaları görünür olmalıdır. Toz, tüy bırakmayan, çizilmelere ve windows veya merkezinde tüm bu iletişim uzlaşma ve ya yağlar çok kolay bir sektörün başka bir çözüm sızıntı ya da merkezinde hep birlikte dışarı sızdıran yol açabilir. Değerli örnekleri bir deney sırasında çözümleri ile ilgili sızan bilgiler, kayıp, camları kırık ve centerpieces sık sık yol açan hücre basınç bir dengesizlik neden kalmaz. Buna ek olarak, fiş contalar ve konut fişler santrifüj odasında yüksek vakum yükleme deliklerden merkezinde sektörünün çıkardı çözümler önlemek için güvenli olmalıdır. Pencere gömlekleri ve contalar, hareket, kırık pencereleri neden olabilir tatili ve çatlaklar ücretsiz olmalıdır.
Bu video örnek hücre montaj prosedürleri göstermek, yardımcı olmak için tork, yükleme ve rotor hizalama bileşeni, mükemmel bir EAA deney sırasında hasar, sızıntı çözüm ve kırılmaları en aza indirir.
Protocol
Discussion
Rotor uygun hücre montajı, örnek ekleme ve hücre hizalama yüksek kaliteli EAA deneyler için kritik öneme sahiptir. Bu makromoleküler sedimantasyon profilleri elde edilen veriler çok ayrıntılı bir analiz gerektiren deneyler için, özellikle de doğrudur, örneğin, protein etkileşimleri eğitim ve eser agrega miktarda belirlenmesi. Genellikle deneysel kurulum kalite, doğruluk ve hassasiyet için EAA çalışmada elde edilen sonuçlar sınırlayıcı. 3 – ve pratik tasarımı EAA deneyler daha da yürütme hakkında ayrıntılı bilgi için, Referanslar 1 bakın. Atölyeler EAA deneylerin pratik kurulum, teori ve veri analizi kapsayan Ulusal Sağlık Enstitüleri bizim laboratuvarda yılda iki kez yapılıyor [4].
Acknowledgements
Biz araştırma desteği, NIH NIBIB İntramural Araştırma Programı tarafından kabul ediyorsunuz.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter | 361964 | ||
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | ||
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | ||
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter | 306812 | ||
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | ||
| Cell Housing kit | Beckman Coulter | 334602 | ||
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | ||
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | ||
| Window, sapphire | Beckman Coulter | 307177 | ||
| Window, quartz | Beckman Coulter | 301730 | ||
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | ||
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter | 306493 | ||
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter | 327022 | ||
| Cell housing plug | Beckman Coulter | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- . Home – Workshops [Internet] Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx
