De analytische ultracentrifuge (AUC) monster cel houdt monster en referentie-buffer en tijdens de experimenten en wordt blootgesteld aan een hoog vacuüm en rotor met snelheden tot 60.000 tpm. Deze video zal aantonen aan de strenge aandacht voor detail nodig is voor de montage, laden en afstemming van deze zeer belangrijke component van een AUC experiment.
De analytische ultracentrifuge (AUC) is een krachtig hulpmiddel biofysische dat ons toelaat om macromoleculaire sedimentatie profielen opnemen tijdens hoge snelheid centrifugeren. Wanneer behoorlijk gepland en uitgevoerd, een AUC sedimentatie snelheid of sedimentatie evenwicht experiment kan veel onthullen over een eiwit met betrekking tot grootte en vorm, sample zuiverheid, sedimentatie coëfficiënt, oligomerization staten en eiwit-eiwit interacties.
Deze techniek vereist echter een rigoureuze niveau van technische aandacht. Meetoplossing het bezit van een in sectoren centrum stuk ingeklemd tussen twee venster assemblages. Ze worden afgesloten met een koppel druk van circa 120 tot 140 in / lbs. Referentie-buffer en het monster worden geladen in het middelpunt sectoren en vervolgens na verzegeling, de cellen zijn precies uitgelijnd in een titanium rotor, zodat de optische detectie systemen zowel monster en referentie-buffer in dezelfde radiale weg middellijn te scannen via elke kern sector tijdens het roteren met een snelheid tot 60, 000 rpm en onder zeer hoog vacuüm
Niet alleen is een goede sample cel montage kritisch, monster cel componenten zijn erg duur en moet goed worden verzorgd, zodat ze in optimale conditie te werken, om lekken en breken te voorkomen tijdens de experimenten. Ga voorzichtig om met windows, want zelfs de geringste barsten of krassen kan leiden tot een breuk in de centrifuge. Het contact tussen de centrale en ramen moeten zo strak mogelijk, dat wil zeggen geen Newton s ringen moeten zichtbaar zijn na het moment druk wordt uitgeoefend. Stof, pluisjes, krassen en oliën op zowel de ramen of het middelpunt elk compromis dit contact en kan heel gemakkelijk leiden tot het lekken van oplossingen van de ene sector naar de andere of uitlekken van de kern samen. Niet alleen zijn waardevolle samples verloren, het lekken van oplossingen tijdens een experiment zal een onbalans van de druk in de cel die vaak leidt tot kapotte ramen en centerpieces veroorzaken. Bovendien moet plug pakkingen en huisvesting stekkers stevig te zijn om oplossingen die worden getrokken uit het middelpunt sector door middel van het laden gaten door de hoge vacuüm in de centrifuge kamer te vermijden. Raam liners en pakkingen moeten vrij zijn van breuken en scheuren die ervoor kunnen zorgen beweging resulteert in gebroken ruiten.
Deze video zal onze procedures van het monster cel montage te tonen, koppel, laad-en rotor aanpassing aan een minimum te beperken component schade, oplossing lekken en breuk tijdens de perfecte AUC experiment.
De juiste cel montage, monster inbrengen, en cel aanpassing in de rotor is van cruciaal belang voor een hoge kwaliteit AUC experimenten. Dit geldt, in het bijzonder voor experimenten die een zeer gedetailleerde analyse van de verkregen gegevens op de macromoleculaire sedimentatie profielen vereisen, bijvoorbeeld bij het bestuderen van eiwit interacties en het bepalen van sporen totaalbedragen. Vaak is de kwaliteit van de experimentele opstelling is beperkt voor de juistheid en de precisie van de resultaten van de AUC studie. Voor meer informatie over de praktische ontwerp en de verdere uitvoering van de AUC experimenten, zie Referenties 1 – 3. Workshops over de praktische opzet, theorie en data-analyse van de AUC experimenten worden twee keer per jaar op ons laboratorium aan de National Institutes of Health [4].
Wij erkennen het onderzoek te ondersteunen door de intramurale Research Program van NIBIB, NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter | 361964 | ||
Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | ||
Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | ||
Spinkote Lubricant | Beckman Coulter | 306812 | ||
Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | ||
Cell Housing kit | Beckman Coulter | 334602 | ||
Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | ||
Window liner | Beckman Coulter | 362329 | ||
Window, sapphire | Beckman Coulter | 307177 | ||
Window, quartz | Beckman Coulter | 301730 | ||
Window holder | Beckman Coulter | 305037 | ||
12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter | 306493 | ||
Cell plug gaskets | Beckman Coulter | 327022 | ||
Cell housing plug | Beckman Coulter | 362327 |