Modelo murino de isquemia dos membros posteriores

1. Indução de isquemia dos membros posteriores unilaterais Os instrumentos cirúrgicos necessários para esta operação são: multa fórceps pontiagudo, uma pinça pontiaguda, tesoura primavera, tesouras cirúrgicas, porta-agulhas e afastador. Nós fazemos nossa própria retrator usando um clipe de papel porque ele é menor do que retratores disponíveis comercialmente. Esterilizar essas ferramentas antes da cirurgia por uma autoclave ou um esterilizador hot-pérola. Uma ferramenta de cautério e estéril fino cotonetes apontou também será necessária para esta cirurgia. Recomenda-se que as ferramentas de ser re-esterilizados nas pontas, conforme necessário durante o procedimento. Quando as ferramentas estão prontas, coloque o mouse na câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min. Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. Recomenda-se lavar o anestésico da caixa antes de abrir a tampa, para diminuir a exposição do operador para o isoflurano. Em seguida, coloque o animal em decúbito dorsal sobre a mesa pré-operacionais e conectá-lo a um fluxo contínuo de isoflurano. Usando um barbeador elétrico, remover os pêlos do membro posterior. Aplique o creme de depilação para remover completamente o cabelo. Posicione o mouse na posição supina sobre uma almofada coberta aquecida na mesa de operação, e conectá-lo a um fluxo contínuo de isoflurano. Ampliar e garantir o membro posterior com um pedaço de fita. Uma vez que o membro posterior é seguro, limpe a pele com três esfrega alternando betadine e álcool. Para o restante do procedimento cirúrgico, o uso de um microscópio de dissecação em 10X ou 20X de ampliação para obter uma visão ampliada da região hindlimb. Utilizando uma pinça fina e tesoura cirúrgica, fazer uma incisão na pele, de aproximadamente 1 cm de comprimento, a partir do joelho para a coxa medial. Usando tampão fosfato (PBS)-umedecidos multa cotonetes apontou, escove delicadamente afastado tecido adiposo subcutâneo em torno do músculo da coxa. Em seguida, aplique o cautério transversalmente ao inciso e dissecar através do tecido de gordura subcutânea para revelar a artéria femoral subjacente. Use um afastador para abrir o ferimento e obter uma melhor visualização da vasculatura dos membros inferiores. Utilizando uma pinça fina e um cotonete bem apontou, gentilmente furar através da bainha membranosa femoral para expor o feixe neurovascular. Em seguida, usando um jogo limpo de uma pinça fina e haste com algodão, dissecar e separar a artéria femoral a partir da veia femoral e do nervo no local proximal, perto da virilha. Após a dissecção, passe um fio de sutura de seda 7-0 debaixo da extremidade proximal da artéria femoral. Oclusão da artéria femoral proximal usando nós dobro. Coloque o empate na embarcação como proximal na ferida quanto possível a fim de deixar tempo para o empate segundo e um segmento de intervenção que será seccionado. Separe a artéria femoral da veia femoral no local distal perto do joelho. Passe um fio de sutura 7-0 debaixo da extremidade distal da artéria femoral proximal até a artéria poplítea. Oclusão do vaso usando nós dobro. Oclusão da artéria femoral distal com um segundo conjunto de nós dobro apenas proximal ao primeiro conjunto de nós. Este segundo conjunto de suturas serão usados ​​para prender a artéria durante o processo de transação. Da mesma forma, para fins de emocionante, oclusão da artéria femoral proximal com um segundo conjunto de nós dobro imediatamente distal ao primeiro conjunto de nós. Transecto o segmento da artéria femoral entre os nós distal e proximal com um cotonete fino e pontudo e uma tesoura de mola. Tenha cuidado para não perfurar a parede da veia femoral. Remover o retrator e fechar a incisão usando Vicryl 5-0. Estas suturas não precisam ser removidos em um momento posterior, como eles se dissolvem sozinhos. Uma vez que a incisão é fechada, colocar o animal em cima de uma almofada coberta aquecida na gaiola de recuperação e monitorar continuamente até que desperto. Depois de origem animal se recuperou de uma hora, prossiga com o passo de perfusão do laser Doppler sangue, a fim de confirmar a indução de isquemia. 2. Laser Doppler perfusão sanguínea Para começar o laser Doppler perfusão passo, coloque o mouse na câmara de indução anestésica contendo 1-3% de isoflurano em oxigênio a 100% a taxa de fluxo de 1l/min. Deixe o mouse na câmara de indução até que ele não responde a estímulos externos. Em seguida, retire o animal da câmara de indução. Recomenda-se lavar o anestésico da caixa antes de abrir a tampa, para diminuir a exposição do operador para o isoflurano. Colocar o animal na mesa pré-operacional conectado ao fluxo contínuo de isoflurano. Em seguida, retire o cabelo da hindlimb usando um barbeador elétrico seguido por creme de depilação, se necessário. Após a remoção do cabelo,colocar o animal em uma superfície de 37 ° C aquecidos por 5 minutos sob fluxo contínuo de isoflurano. Monitorar a temperatura do núcleo para garantir euthermia, como mudanças de temperatura irá afetar significativamente a perfusão. Após 5 minutos, colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma superfície não-reflexiva de absorção de luz, como pano de cor verde, conectado a um fluxo contínuo de isoflurano. Estender membros posteriores. Em seguida, ligue a impressora a laser Doppler e do software de aquisição e inicializar o software. Especificar o tamanho do campo de visão e resolução. É melhor para manter o campo de visão e densidade de pixels consistente entre os animais, a fim de tornar a análise futura mais fácil. Abra um novo arquivo. Prima start para iniciar a aquisição dos dados de imagem. Geralmente, o gerador de imagens detecta automaticamente a distância do mouse, mas se solicitado, especifique a distância do animal para o gerador de imagens. O laser vai mostrar as fronteiras do campo de visão e, em seguida, começar a adquirir dados. Após a aquisição for concluída, a imagem começará a mostrar uma gama de cores que são indicativos do nível de perfusão de sangue para as pernas. As cores podem ser definidas para uma gama específica de perfusão para melhor comparar os dados entre os animais. Quando a aquisição de dados estiver concluída, salve o arquivo. Em seguida, retornar o animal para a gaiola de recuperação e monitorar o animal continuamente até que desperto. Para analisar os dados, use o ajuste de limite no software de análise para subtrair qualquer ruído de fundo. Um limite de 0,2 geralmente é um valor razoável. Selecionar 2 regiões de interesse, ou ROIs, que cobrem cada área hindlimb. A variedade de pontos de referência pode ser usada para padronizar o ROI entre os membros e os animais. Em seguida, determinar a perfusão média e variabilidade no ROI. A diferença de perfusão e perfusão entre o membro isquêmico e membro de controle pode então ser facilmente determinada. Este procedimento pode ser repetido para acompanhar as alterações na perfusão hindlimb ao longo do tempo. Em um ponto de tempo desejado, o animal pode ser sacrificado para avaliação da função do tecido e comparação com dados de imagem de perfusão. 3. Resultados representativos: A anatomia da vasculatura hindlimb é mostrado na Figura 1 2. Um diagrama representativo da hindlimb após explante artéria femoral é mostrado na Figura 2. Para confirmar a indução de isquemia para o membro posterior, laser Doppler análise de imagens de perfusão demonstra uma redução dramática no fluxo sangüíneo para o membro isquêmico, em comparação com o membro de controle, como mostrado na Figura 3. Figura 1. Anatomy da vasculatura hindlimb. Asteriscos indicam os locais de ligação para a indução de isquemia hindlimb. Figura 2. Diagrama Representante mostrando a anatomia do membro posterior após a ligadura da artéria femoral na porção proximal e distal após a remoção da artéria femoral. Figura 3. Laser Doppler imagens mostrando o fluxo de sangue antes e após a indução de isquemia para o membro posterior esquerda (indicada pela seta).