Modello murino di ischemia degli arti posteriori

1. Induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterali Gli strumenti chirurgici necessari per questa operazione sono: belle pinze a punta, pinze a punta, forbici primavera, forbici chirurgiche, porta aghi, e divaricatore. Noi facciamo il nostro retrattore usando una graffetta, perché è più piccolo di divaricatori disponibili in commercio. Sterilizzare questi strumenti prima di un intervento da parte di un autoclave o di un hot-tallone sterilizzatore. Uno strumento di cauterizzazione e sterile, tamponi di cotone fatto bene sarà anche necessaria per questo tipo di chirurgia. Si raccomanda che gli strumenti essere ri-sterilizzati alle punte, se necessario durante la procedura. Quando gli strumenti sono pronti, posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min. Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Si consiglia di lavare l'anestetico dalla finestra prima di aprire il coperchio, per ridurre l'esposizione dell'operatore isoflurano. Poi posto l'animale in posizione supina sul tavolo pre-operativi e collegarlo a un flusso continuo di isoflurano. Utilizzando un rasoio elettrico, togliere i capelli dalla arti posteriori. Applicare la crema di rimozione dei capelli per rimuovere completamente i capelli. Posizionare il mouse in posizione supina su un pad riscaldato drappeggiato sul tavolo operatorio, e collegarlo a un flusso continuo di isoflurano. Estendere e proteggere le arti posteriori con un pezzo di nastro adesivo. Una volta che l'arti posteriori è sicuro, pulire la pelle con tre scrub alternati Betadine e alcol. Per il resto della procedura chirurgica, l'uso di un microscopio a dissezione 10X o 20X di ingrandimento di ottenere una visione allargata della regione degli arti posteriori. Utilizzando una pinza sottile e forbici chirurgiche, fare un'incisione della pelle, circa 1 cm di lunghezza, dal ginocchio verso la coscia mediale. Utilizzando tampone fosfato (PBS)-tamponi di cotone inumiditi multa a punta, delicatamente spazzare via tessuto adiposo sottocutaneo che circondano il muscolo della coscia. Successivamente, applicare il cauterio trasversalmente a incidere e sezionare attraverso il tessuto grasso sottocutaneo per rivelare l'arteria femorale sottostante. Utilizzare un divaricatore per aprire la ferita e per ottenere una migliore visione del sistema vascolare delle estremità inferiori. Utilizzando una pinza sottile e un batuffolo di cotone sottile a punta, delicatamente trafiggerà la guaina membranosa femorale per esporre il fascio neurovascolare. Poi, utilizzando una serie pulita di una pinza sottile e tampone di cotone, sezionare e separare l'arteria femorale dalla vena femorale e al nervo posizione prossimale vicino all'inguine. Dopo la dissezione, passare un filo di sutura di seta sotto 7-0 alla fine prossimale dell'arteria femorale. Occludere l'arteria femorale prossimale con doppi nodi. Posizionare la cravatta sulla nave come prossimale nella ferita il più possibile in modo da lasciare lunghezza per il pareggio secondo e un segmento di intervento che verranno recisi. Separare l'arteria femorale dalla vena femorale nella posizione distale vicino al ginocchio. Passare un filo di sutura sotto 7-0 alla fine distale dell'arteria femorale prossimale all'arteria poplitea. Occludere il vaso con doppi nodi. Occludere l'arteria femorale distale con una seconda serie di doppi nodi appena prossimale alla prima serie di nodi. Questa seconda serie di punti di sutura saranno utilizzati per la presa l'arteria durante la procedura di transazione. Allo stesso modo, per scopi di presa, occludere l'arteria femorale prossimale con una seconda serie di doppi nodi appena distale rispetto alla prima serie di nodi. Transetto il segmento di arteria femorale tra i nodi distali e prossimali con un tampone di cotone sottile a punta e un paio di forbici primavera. Fare attenzione a non forare la parete della vena femorale. Rimuovere il riavvolgitore e chiudere l'incisione con 5-0 punti di sutura Vicryl. Questi punti di sutura non devono essere rimosse in un secondo momento, come si dissolvono da soli. Una volta che l'incisione è chiuso, l'animale posto in cima ad un pad riscaldato drappeggiata nella gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando sveglio. Dopo animale ha recuperato per 1 ora, procedere con il passaggio del sangue perfusione laser Doppler per confermare l'induzione di ischemia. 2. Laser Doppler sangue perfusione Per iniziare la perfusione laser Doppler passo, posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia contenente 1-3% isoflurano in ossigeno al 100% con un flusso di 1L/min. Lascia il mouse nella camera di induzione fino a che non non risponde agli stimoli esterni. Quindi rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Si consiglia di lavare l'anestetico dalla finestra prima di aprire il coperchio, per ridurre l'esposizione dell'operatore isoflurano. Posto l'animale sul pre-tavolo operatorio collegato al flusso continuo di isoflurano. Quindi rimuovere il pelo dal arti posteriori con un rasoio elettrico seguito da crema di rimozione dei capelli, se necessario. Dopo aver rimosso i capelli,posto l'animale su una superficie di 37 ° C riscaldata per 5 minuti sotto flusso continuo di isoflurano. Monitorare la temperatura interna per assicurare euthermia, come sbalzi di temperatura sarà notevolmente influenzare la perfusione. Dopo 5 minuti, mettere l'animale in posizione supina su una base non-riflettenti che assorbono la luce di superficie come colore verde panno, collegato ad un flusso continuo di isoflurano. Estendere l'arti posteriori. Successivamente, accendere il laser Doppler imager e il software di acquisizione e inizializzare il software. Specificare la dimensione del campo visivo e la risoluzione. E 'meglio tenere il campo visivo e la densità dei pixel coerenti tra gli animali in modo da rendere più facile l'analisi future. Aprire un nuovo file. Premere start per iniziare l'acquisizione dei dati immagine. In generale, l'imager rileva automaticamente la distanza del mouse, ma se richiesto, specificare la distanza degli animali per l'imager. Il laser mostra i confini del campo di vista e quindi iniziare l'acquisizione dati. Dopo l'acquisizione è stata completata, l'immagine inizia a mostrare una gamma di colori che sono indicative del livello di perfusione di sangue alle gambe. I colori possono essere impostati per una vasta perfusione specifica per confrontare meglio i dati tra gli animali. Quando l'acquisizione dei dati è completa, salvare il file. Poi rispedire l'animale verso la gabbia di recupero e monitorare continuamente fino a quando l'animale sveglio. Per analizzare i dati, utilizzare la regolazione della soglia del software di analisi per sottrarre qualsiasi rumore di fondo. Una soglia di 0,2 di solito è un valore ragionevole. Selezionare 2 regioni di interesse, o ROI, che coprono ogni area degli arti posteriori. Una varietà di punti di riferimento possono essere utilizzate per standardizzare il ROI tra le arti e gli animali. Quindi determinare la perfusione media e variabilità del ROI. La differenza e il rapporto perfusione perfusione tra l'arto ischemico e degli arti di controllo può essere facilmente determinato. Questa procedura può essere ripetuta per seguire i cambiamenti della perfusione degli arti posteriori nel tempo. Ad un certo punto di tempo desiderato, l'animale può essere eutanasia per la valutazione della funzione di tessuti e di confronto per i dati delle immagini di perfusione. 3. Rappresentante dei risultati: L'anatomia della vascolarizzazione degli arti posteriori è illustrato nella figura 1 2. Un diagramma rappresentante della arti posteriori dopo espianto arteria femorale è illustrato nella figura 2. Per confermare l'induzione di ischemia agli arti posteriori, l'analisi della perfusione laser Doppler immagine mostra una drastica riduzione del flusso di sangue per l'arto ischemico, rispetto al controllo degli arti, come mostrato nella Figura 3. Figura 1. Anatomia della vascolarizzazione degli arti posteriori. Asterischi indicano le posizioni dei legatura per l'induzione di ischemia degli arti posteriori. Figura 2. Diagramma rappresentante che mostra l'anatomia delle arti posteriori dopo la legatura dell'arteria femorale nei siti prossimale e distale dopo la rimozione l'arteria femorale. Figura 3. Laser Doppler immagini che mostrano il flusso di sangue prima e dopo l'induzione di ischemia agli arti posteriori sinistra (indicato dalla freccia).